高壓氧結合電針治療對脊髓損傷后大鼠膀胱功能的影響

王曉紅，邵 彬，黃禮群

(廣州軍區武漢總醫院康復理療科，武漢 430070)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)可引起下尿路排尿功能障礙(神經源性膀胱)，嚴重時可伴發致死性尿路感染或慢性腎衰竭[1]。臨床實踐已證實高壓氧是治療SCI的重要方法，但高壓氧治療神經源性膀胱的機制尚不清楚，其可能的機制是高壓氧可以保護神經細胞，促進神經纖維再生[2]，從而誘發或重建正常的排尿反射；電針可以通過多環節延緩和減輕SCI的程度，改善損傷后并發癥[3]，同時大量臨床實踐也證實電針在改善SCI后排尿功能方面具有獨特療效[4-5]，本文旨在觀察高壓氧結合電針治療對SCI后大鼠膀胱功能的影響，從而為臨床治療SCI后神經源性膀胱提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物為健康雌性SD大鼠60只(鼠齡 4～6周)，體質量250～350 g，按隨機數字表法分為3組：對照組、高壓氧組和高壓氧結合電針組(結合電針組)，每組20只；各組又按手術后相應時間點分為24 h，3 d、7 d、14 d組，每組5只。實驗動物由廣州軍區武漢總醫院醫學實驗中心提供，飼養溫度為20～23 ℃，濕度為50%～60%，大鼠在籠內自由進食飲水。

1.2方法

1.2.1實驗動物模型制備 采用Allen′s 重物撞擊法制造大鼠SCI模型。稱取大鼠體質量后，給予10%水合氯醛溶液按4 mL/kg腹腔內注射麻醉，然后用電子剃毛器剃去大鼠背部毛發，以T12為中心顯露直徑約為0.5 cm的圓形無菌區，作為SCI區。將大鼠固定在鼠臺上，以T12棘突為中心背部正中縱行切口，長約3 cm，顯露脊柱后，在T11～12間用血管鉗小心咬除棘突和雙側椎板，露出白色的脊髓后，用致傷量為50 g/cm2的Allen′s重物撞擊法損傷脊髓，大鼠的雙下肢出現回縮性撲動、尾巴呈痙攣性擺動后雙下肢癱瘓，表明造模成功，然后依層次縫合。術后給予青霉素腹腔注射預防感染。所有大鼠均接受Allen′s 重物撞擊法制造SCI模型，造模成功后12 h按不同組別給予相應治療，其中對照組不接受任何治療，高壓氧組僅接受高壓氧治療，結合電針組接受高壓氧及電針治療。

1.2.2高壓氧治療 高壓氧組及結合電針組大鼠于術后12 h進艙，先用純氧洗艙10 min ，使艙內氧濃度大于95%，20 min內緩慢加壓至0.25 MPa。在高壓下停留60 min，其間用純氧通風10 min，停留結束后在20 min內勻速減壓至常壓，結束治療。高壓氧治療每天1次。

1.2.3電針治療 結合電針組大鼠于高壓氧治療后開始電針治療，電針治療參數：輸出電壓4～6 V，疏波4 Hz，密波20 Hz，留針20 min，每天1次。取穴及針刺方法[6]：大椎穴，背中線上，C7與T1棘突間，順棘突間直刺5 mm；腎俞穴，L2棘突下兩旁，直刺6 mm；三陰交穴，后肢內踝尖直上10 mm，直刺5 mm。

1.2.4尿流動力學檢查 大鼠稱體質量后，先以25%烏拉坦按1.0 g/kg腹腔注射麻醉[7]，30 min后經尿道插入3號輸尿管導管，將大鼠放入測壓籠內，設置室溫為30 ℃。輸尿管導管接上三通，用注射器抽出膀胱內尿液后，三通一端與微量灌注泵相接，另一端接尿動力儀的膀胱壓力傳感器，體內置零。再以0.2 mL/min的速度向膀胱內灌注室溫下生理鹽水，至大鼠開始排尿時停止注水。測定排尿量，以1 mL注射器抽出膀胱內殘余尿。連續測量3次。膀胱測量指標為膀胱容量(灌注速度×灌注時間)、排尿量、殘余尿量(膀胱容量-排尿量)、排尿速率、最大排尿壓。

1.2.5取材 分別在造模后24 h,3、7、14 d處死大鼠。處死前大鼠完成尿流動力學檢測，檢測后開胸暴露心臟，心臟灌注冰生理鹽水至流出液為清亮后給予4%的多聚甲醛溶液繼續灌注，灌注完成后取出受損脊髓節段頭端3 mm、尾端3 mm的脊髓組織，及大鼠膀胱標本放入相同灌注液中，置入4 ℃冰箱過夜。乙醇脫水石蠟包埋并切片，其中脊髓切片為頭端5 μm，尾端5 μm各一張。

1.2.6神經型一氧化氮合酶(Neuronal nitric oxide synthase，nNOS)表達檢測 根據GENE TECH 公司兩步法抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒說明書進行，石蠟切片置于65 ℃烘箱中，烘片2 h，脫蠟至水，用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次5 min；高壓熱修復：在沸水中加入Na2EDTA(pH 9.0)。蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5 min，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10 min后除去熱源，自然冷卻。切片放入3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶。PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次5 min；甩去PBS液，第一抗體1∶100濃度稀釋。每張切片加入50 μL稀釋液，4 ℃過夜；PBS沖洗3次，每次5 min；甩去PBS液，每張切片加50～100 μL A液(ChemMateTMEnVision+/HRP)，室溫下孵育45 min；PBS沖洗3次，每次3 min；甩去PBS液，每張切片加50～100 μL新鮮配制的DAB溶液，室溫下孵育5 min，顯微鏡控制顯色；顯色完全后，蒸餾水或自來水沖洗，蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，PBS沖洗返藍；切片經過梯度乙醇(70%～100%)脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固；用PBS代替一抗做陰性對照，高倍視野(×400)下計算陽性細胞率，即每張切片隨機取出10個不重疊高倍視野，算出陽性細胞率。

2 結 果

2.1nNOS在脊髓及膀胱組織中的表達 在各時間點上，對照組、高壓氧組及結合電針組的脊髓及膀胱組織中均有表達(封2圖1)，陽性細胞即為細胞質內棕黃色染色顆粒；免疫組化結果顯示，在各時間點上，高壓氧組及結合電針組nNOS陽性細胞表達均高于對照組(P<0.01)，結合電針組的陽性細胞數顯著高于高壓氧組(P<0.05)，見表1。

2.2尿流動力學分析 尿流動力學結果顯示，對照組、高壓氧組及結合電針組尿流動力學指標在術后24 h比較，差異無統計學意義(P>0.05)；術后3 d及以上，高壓氧組及結合電針組各項尿流動力學指標均優于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；術后7、14 d，結合電針組的尿流動力學指標明顯優于高壓氧組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 nNOS在脊髓及膀胱組織中陽性細胞率的表達±s，%)

表2 各組尿流動力學的影響±s)

續表2 各組尿流動力學的影響±s)

3 討 論

由于控制膀胱的中樞或周圍神經傷病所引起的排尿功能障礙，稱為神經源性膀胱，它是SCI的常見合并癥之一[8]。神經源性膀胱引起嚴重尿潴留、尿路感染、膀胱內高壓、膀胱-輸尿管反流，甚至發生慢性腎衰竭，是截癱患者的首位死亡原因。1987～1988年，中國康復研究中心對唐山地震后因SCI造成截癱死亡的374例患者進行調查，發現腎衰竭占死因的40%以上。

國內外研究表明，氮能神經遞質合成減少在神經源性膀胱發病過程中起重要作用。由于一氧化氮(nitric oxide,NO)的化學性質極不穩定，目前主要是通過檢測一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)及其降解產物的含量間接了解NO的變化。NOS陽性神經纖維廣泛分布于膀胱及尿道組織，NO通過NO-cGMP信號途徑舒張下尿路平滑肌，降低正常排尿時的尿道壓，對維持正常的膀胱儲、排尿功能有重要意義[9-11]。敲除nNOS基因的小鼠膀胱-尿道括約肌功能紊亂，有排尿困難、尿頻等癥狀[12]。神經源性膀胱逼尿肌、膀胱頸平滑肌中氮能神經遞質含量明顯下降,從而使逼尿肌興奮性升高，膀胱收縮與舒張功能失調，導致排尿障礙[13]。國內研究報道電針治療使SCI后大鼠膀胱逼尿肌及膀胱頸平滑肌中nNOS 表達增加，從而改善大鼠排尿功能[14-15]；高壓氧治療可以促進損傷后脊髓的神經細胞再生[16-17]，在本文的前期研究中，發現高壓氧能夠顯著減少SCI大鼠神經元細胞凋亡的同時，還能改善SCI大鼠的肢體功能及行為學評分[18]。

本實驗結果表明，在術后各時間點上，高壓氧組及結合電針組nNOS陽性細胞表達均高于對照組(P<0.01)，結合電針組的陽性細胞數顯著高于高壓氧組(P<0.05)；術后7、14 d，結合電針組的尿流動力學指標明顯優于高壓氧組，差異有統計學意義(P<0.05)，說明高壓氧及電針治療都能改善SCI后大鼠尿流動力學指標，且都與脊髓及膀胱組織中氮能神經遞質的合成與釋放增加有關。所以本研究認為高壓氧與電針相結合治療SCI后神經源性膀胱，能夠更好地改善SCI后大鼠的膀胱功能。其機制可能是：(1)高壓氧能明顯增加損傷脊髓組織氧張力，調節微循環功能，減輕脊髓水腫，保護神經細胞，促進神經纖維再生，同時高壓氧也能提高脊髓對缺氧的耐受性[19]，使脊髓神經元細胞缺血缺氧狀態得到改善，繼而使更多殘存的神經細胞免于繼發性損傷，更多地保留支配膀胱的神經功能。(2)中醫認為SCI的病因病機是由于督脈受損，電針督脈(大椎穴)可以改善SCI局部組織的血液微循環，又能促進腦脊液流動，減輕SCI 部位的水腫和血腫的壓迫及粘連，從而扼制了脊髓繼發性損傷的進行[20]；三陰交是足三陰經交會穴，三陰經循行少腹或陰器，能通調下焦之氣機，推測電針刺激通過反射弧到脊髓后根激發腰骶部排尿中樞，引起反射性排尿；腎俞穴內有第1、2腰髓側角發出的交感神經纖維，可使尿道內括約肌收縮，而使膀胱容量增大，減少排尿次數。同時電針治療具有清除自由基和抑制氧化應激反應的作用，從而提高氧化能力，改善急性SCI，這也可能是電針改善SCI作用途徑之一[21]。(3)本實驗數據表明，高壓氧結合電針治療使nNOS表達顯著增加，使氮能神經遞質合成增加，并使膀胱和尿道組織中抑制性神經遞質水平升高，尿道及膀胱頸痙攣減輕，平滑肌舒張，尿道阻力降低，逼尿肌舒張，無抑制收縮頻率減少，膀胱順應性提高，由此改善大鼠尿流動力學指標，排尿障礙癥狀改善。總之，高壓氧結合電針治療對SCI后大鼠的神經元具有保護作用，并能很好改善大鼠的膀胱功能。

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