1株具有低營養抗逆特性的嗜麥芽寡養單胞菌的分離和鑒定

楊菌，楊淑霞，鄒強，劉陽，梁紅，袁杰，沈小旭，吳永琴，張杰，李敏惠＊

（成都醫學院 1.生物醫學系；2.科研實驗中心；3.臨床醫學系，成都 610083）

醫院內病原微生物的廣泛分布是導致院內感染的關鍵因素，而病原微生物不但給病人的康復帶來巨大威脅，也給醫用儀器的消毒維護和檢測結果的可靠性造成一定的干擾。從醫用檢驗和治療儀器上分離并鑒定病原微生物，既可以優化儀器的維護方法，又將為院內微生物感染的防治奠定基礎。

流式細胞術（flow cytometry）具有操作簡便、分析快速及結果客觀、精確等優點，已成為實驗室科學和臨床檢驗醫學應用與研究的熱點之一［1］。流式細胞儀的流動室直接接觸臨床樣品（特別是血液樣品），檢測后可能會有少量臨床樣品中攜帶的病原微生物殘留于此，給流式細胞儀的日常消毒和維護帶來巨大挑戰。在對流式細胞儀進行消毒維護時，我室主要采用“強氧化劑——次氯酸鈉消毒液反復沖洗流式細胞儀的流動室及管路”的策略，這種策略通常可以清除所有殘留于流式細胞儀管路中的微生物。然而，我室近來卻從上述常規消毒維護的流式細胞儀流動室中分離得到了一株具有高抗逆（強氧化劑、極低營養環境）能力的種屬未知的細菌，次氯酸鈉等常規消毒策略均無法對其進行徹底滅殺。本研究將對這株未知微生物的種屬及抗逆特性進行初步鑒定，為豐富抗逆微生物的資源和流式細胞儀的消毒維護奠定重要基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

實驗所用菌株分離自流式細胞儀（FACS calibur，BD）的流動室，菌株編號為YL08。

1.2 培養基與試劑

LB培養基：酵母提取物5.0g／L，蛋白胨10.0 g／L，NaCl 10.0g／L，pH 7.4。PBS緩沖液：NaCl 8.5g／L，Na2HPO4·12H2O 3.5g／L，NaH2PO4· 2H2O 0.25g／L，PH 7.6。Taq DNA聚合酶及dNTPs（Fermentas）；蛋白酶K（Roche）；引物合成（SANGON）；λ－HindIII digest和DL 2000標準核酸分子量（TAKARA）。

1.3 菌株形態鑒定

將菌株YL08在LB培養基上35℃培養2～3d后觀察菌落形態。挑取菌體涂片，革蘭氏染色后，用光學顯微鏡觀察菌體特征。

1.4 低營養抗逆特性

收集LB培養基培養的YL08菌液，PBS緩沖液洗滌，去除營養培養基后儲存于PBS緩沖液中，35℃100r／min振蕩培養；每間隔7d從PBS菌液中挑取適量菌液，LB固體培養基上劃線，35℃恒溫培養，通過觀察菌體能否復蘇判定其在無營養條件下的抗逆生存能力。

1.5 分子生物學鑒定

1.5.1 基因組DNA的提取

采用CTAB法提取YL08基因組DNA。取2g菌體，液氮研磨至白色粉末狀，轉入50ml無菌離心管中，加入5.0ml CTAB抽提緩沖液（2%CTAB，100mmol／LTris－HCl，20mmol／LEDTA，1.4 mmol／L NaCl，2%β－巰基乙醇，0.1mg／ml蛋白酶K）和1／10體積的10%SDS，振蕩混勻；65℃水浴30min；冷卻至室溫；4℃，12 000r／min，離心5 min。取上清，加等體積酚／氯仿／異戊醇（25：24：1），4℃12 000r／min離心5min；取上清，加入等體積氯仿／異戊醇（24∶1），離心；加入兩倍體積冰預冷無水乙醇，－20℃過夜，離心；70%乙醇洗滌沉淀2次，100μl TE（PH 8.0）溶解，－20℃保存。

1.5.2 DNA定性及定量分析

取2μl制備的基因組DNA原液，用ND－1000型（Nano Drop）微量紫外分光光度計檢測基因組DNA的濃度以及OD260值，每樣重復3次。取2μl樣品進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統（Bio Rad）進行DNA完整性分析。

1.5.3 16SrDNA序列PCR擴增

采用16SrDNA特異性引物F27／R1492擴增，F27： 5′－AGAGTTTGATCNTGGCTCAG－3′，R1492：5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′，擴增產物長度為1 500bp。反應體系25μl：DNA 1.0 μl，10×buffer 2.5μl，25mmol／L MgCl23.0μl，5 U／μl Taq polymerase 0.2μl，10mmol／L dNTP mix 1.0μl，10μmol／L引物各1.0μl，ddH2O 15.3 μl。擴增參數：95℃變性5min，35個熱循環（95℃45s，52℃45s，72℃45s），72℃延伸10min。

1.5.4 16SrDNA序列測定及分析

將PCR擴增產物送至上海生工測序，將YL08菌株16SrDNA測序結果在NCBI網站上使用BLAST程序比對，從GenBank數據庫中獲得標準序列數據，采用MEGA5軟件繪制系統發育樹。

2 結果

2.1 細菌形態學及低營養抗逆特性的鑒定

YL08菌株在LB培養基上35℃培養48h后，菌落呈乳黃色、圓形、隆起、不透明、邊緣整齊、有粘性。細菌鏡檢（×1000）結果顯示YL08分離株呈短小桿狀，革蘭氏染色呈陰性。YL08菌株在無營養條件下的抗逆生存能力極強，在無營養的PBS緩沖液中至少可以生存6個月而不會死亡。

2.2 基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測

用質量分數為0.8%的瓊脂糖凝膠對YL08菌株的基因組DNA作電泳檢測，通過凝膠成像分析系統照相并觀察，結果見圖1，在約23kb處出現YL08基因組DNA目標條帶，可以滿足后續16S rDNA擴增的需要。

2.3 基因組DNA的定量檢測

紫外分光光度計檢測YL08菌株基因組DNA的制備效率，結果顯示DNA濃度和純度較好，DNA濃度為98.6ng／μl，OD260／OD280＝1.88。

2.4 16SrDNA的PCR擴增結果

以YL08菌株基因組DNA樣品為模板，采用特異性引物F27／R1492進行PCR擴增，產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測（見圖2），在1 500bp處出現特異性條帶，且無明顯拖尾現象，說明PCR擴增成功，能滿足后續測序的需要。

2.5 16SrDNA序列分析

將YL08菌株l6SrDNA的PCR擴增產物測序，并經BLAST同源性檢索，結果顯示該序列與嗜麥芽寡養單胞菌的相應序列的同源性99.9%；系統進化樹分析（圖3）證實YL08菌株與嗜麥芽寡養單胞菌的親緣關系最近，其遺傳距離為0.001。

3 討論

本研究證實了我室從流式細胞儀流動室中分離得到YL08菌株為嗜麥芽寡養單胞菌。嗜麥芽寡養單胞菌為條件致病菌和醫院感染菌，具有較強的耐藥性和抗逆性［2］，采用次氯酸鈉法對流式細胞儀的流動室進行常規消毒維護，無法將其徹底滅殺。因此，為避免嗜麥芽寡養單胞菌的殘留對流式檢測結果的影響，在采用流式細胞術檢測臨床血液標本后，可以考慮適當添加嗜麥芽寡養單胞菌敏感的消毒劑，以杜絕該類細菌的殘留。

圖3 YL08菌株16SrDNA的系統發育進化樹

本研究同時還證實了YL08分離株具有強大的低營養抗逆特性，在無營養的PBS緩沖液中可以存活半年以上。逆境環境下，微生物可以通過在生物體內大量儲備抗逆因子（如海藻糖等生物活性物質）來幫助生物體抵御外界不良環境的傷害，使之在一種極低的新陳代謝狀態中長期生存，這些抗逆因子對生物起著不可替代的抗逆境保護作用［3－6］。此外，一些貧營養水體中的微生物大多具有高效的丙氨酸運輸系統，而缺乏對一些關鍵代謝中間物（如琥珀酸）的運輸系統［7－8］。嗜麥芽寡養單胞菌YL08分離株之所以可以在無營養的PBS緩沖液中長時間存活，是基于其抗逆因子介導的抗逆保護機制還是基于其獨特的能量運輸系統，這將是本課題組今后對YL08分離菌抗逆分子機制研究的主要方向。

綜上所述，本研究從流式細胞儀流動室中分離得到1株具有低營養抗逆特性的嗜麥芽寡養單胞菌YL08株，這將為流式細胞儀的消毒維護及YL08分離株的低營養抗逆保護機制研究奠定基礎。

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