雷公藤多甙誘導SCID小鼠體內(nèi)HL-60細胞凋亡的研究

唐加明 梁國華 陳曉昀 朱玉峰

中藥雷公藤具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，常用于治療自身免疫性疾病。文獻報道雷公藤還有抗腫瘤作用[1]。我們體外研究顯示雷公藤多甙對HL-60細胞有明顯地誘導凋亡作用，表明雷公藤多甙在體外實驗中具有抗白血病活性[2]。但是，在體外實驗中具有抗腫瘤活性的藥物在體內(nèi)抗腫瘤效果并不確定。因此，本研究通過構(gòu)建重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠人HL-60細胞白血病模型，觀察雷公藤多甙在體內(nèi)對白血病細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人急性髓系白血病HL-60細胞株，購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

3～4周齡、雌性、SPF級SCID小鼠30只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。所有小鼠飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院實驗動物中心，小鼠在層流架內(nèi)帶蓋鼠盒中飼養(yǎng)(符合 SPF標準)。

1.3 試劑與儀器

雷公藤多甙為上海醫(yī)科大學紅旗制藥廠產(chǎn)品。TUNEL試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.4 細胞培養(yǎng)

HL-60細胞用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每周換液2次。取指數(shù)生長期細胞進行移植。

1.5 SCID小鼠人HL-60細胞白血病模型的建立

SCID小鼠移植前未作任何處理。取體外培養(yǎng)的指數(shù)生長期的HL-60細胞用于移植，用生理鹽水洗滌2次后，每只鼠從靜脈接種3×106個細胞。

1.6 實驗分組及給藥方法

用生理鹽水溶解雷公藤多甙。30只小鼠隨機分為3組，每組10只：①雷公藤多甙組：于成功接種后第22天開始，每只小鼠腹腔注射雷公藤多甙1 mg/(kg·d)，終體積為0.2 ml/d×10天；②模型組：于成功接種后第22天開始，每只小鼠連續(xù)10天腹腔注射生理鹽水0.2 ml/d；③空白組：未接種HL-60細胞，與上述兩組同時開始腹腔注射等量生理鹽水。

1.7 生存情況觀察

記錄各組小鼠的一般情況。白血病小鼠(模型組及雷公藤多甙組)的生存期從接種當日開始計算。

1.8 血象觀察

剪尾采血，行白細胞計數(shù)。涂片，瑞氏染色，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并分類。

1.9 脾臟病理及細胞凋亡檢測

斷頸處死小鼠，迅速取其脾臟，常規(guī)操作制成病理切片，觀察病理形態(tài)改變。按照TUNEL試劑盒說明書進行操作，檢測脾臟細胞凋亡情況。

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 血象改變

經(jīng)尾靜脈接種HL-60細胞后第22天，20只SCID小鼠的外周血中均出現(xiàn)了與體外培養(yǎng)的HL-60細胞形態(tài)類似的白血病細胞見表1。給藥10天后，與模型組比較，雷公藤多甙組外周血白細胞總數(shù)及白血病細胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)，見表2。

2.2 脾臟病理改變

病程后期，模型組小鼠脾臟中可見大量白血病細胞浸潤。與模型組比較，雷公藤多甙組小鼠脾臟中白血病細胞浸潤程度明顯減輕。

2.3 脾臟細胞凋亡率

空白組小鼠脾臟內(nèi)未見凋亡細胞。模型組細胞凋亡率為(7.2±1.5)%，雷公藤多甙組與模型組比較，細胞凋亡率明顯增高(21.6±2.4)%，P<0.05。

2.4 生存期比較

與未接種HL-60細胞的小鼠相比，晚期白血病小鼠均有不同程度地體重下降、精神不振、食欲下降、懶動、行走不穩(wěn)等表現(xiàn)。與模型組比較，雷公藤多甙組的一般情況較好，生存期明顯延長[(38.2±4.1)d，(52.6±5.3)d]，P<0.05。

表1 SCID 小鼠接種HL -60細胞后血象變化(%)

表2 雷公藤多甙給藥10天后白血病小鼠血象情況(%)

* 為與模型組比較，P<0.05

3 討論

雷公藤多甙是衛(wèi)矛科雷公藤根經(jīng)去皮、提取而成的1種中成藥，臨床上主要用于自身免疫性疾病的治療。研究發(fā)現(xiàn)雷公藤還有抗腫瘤作用。雷公藤對L615，L1210以及P388白血病細胞和來自人體鼻咽癌(KB)細胞均有抑制作用。雷公藤對人白血病細胞系HL-60細胞軟瓊脂中集落形成也有抑制作用。雷公藤的抗腫瘤成分主要有雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷公藤內(nèi)脂和雷公藤酮等[1]。近來，中國科學院與美國合作，經(jīng)抗癌機理研究，證實雷公藤紅素具有抗癌蛋白酶體抑制作用，能誘發(fā)前列腺癌和白血病的癌細胞凋亡[3]。最近研究還發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素對逆轉(zhuǎn)K562 /A02 細胞的耐藥性有一定的作用[4]，臨床研究發(fā)現(xiàn)雷公藤多甙能治療子宮肌瘤[5]。陸介芳等[6]用雷公藤的提取物雷公藤多甙治療1例對瘤可寧及COP方案治療無效的慢性淋巴細胞白血病患者，結(jié)果獲得顯效。我們體外研究顯示雷公藤多甙對HL-60細胞有明顯誘導凋亡作用，后來國內(nèi)其他作者研究也得出類似結(jié)果,表明雷公藤多甙在體外實驗中具有抗白血病活性[7～9]。但是，很多在體外實驗中具有抗腫瘤活性的藥物在體內(nèi)抗腫瘤效果并不確定，需要進一步通過動物實驗來明確。

重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠是美國Bosma證實的屬CB-17近交系小鼠第16號常染色體發(fā)生隱性突變基因(SCID)的突變型小鼠。純合的SCID鼠基因?qū)е滦∈髱缀跬耆珕适和B淋巴細胞的功能，因此，這類小鼠是用于建立移植性人腫瘤模型的理想動物[10]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)尾靜脈接種HL-60細胞后第22天，20只SCID小鼠的外周血中均出現(xiàn)了與體外培養(yǎng)的HL-60細胞形態(tài)類似的白血病細胞。病程后期，模型組小鼠的脾臟中可見大量白血病細胞浸潤。與未接種HL-60細胞的小鼠相比，至發(fā)病晚期，白血病小鼠均有不同程度的體重下降、精神不振、食欲下降、懶動、行走不穩(wěn)等一般情況差的表現(xiàn)。這些證據(jù)表明，本研究成功建立了重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠人HL-60細胞白血病模型，與文獻報道的類似[10]。進一步應(yīng)用該模型進行體內(nèi)研究結(jié)果顯示，與模型組比較，雷公藤多甙組小鼠的外周血白細胞總數(shù)及白血病細胞數(shù)均明顯減少、脾臟中白血病細胞浸潤程度明顯減輕、脾臟細胞凋亡率明顯增高、一般情況較好、生存期明顯延長。這些證據(jù)表明，雷公藤多甙在體內(nèi)具有抗白血病作用，其機制是通過誘導HL-60細胞凋亡，其潛在抗白血病的臨床應(yīng)用價值值得進一步開發(fā)。

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