microRNAs在肺癌研究中的進展

丁 罡綜述 黃 鋼審校

在世界范圍內，肺癌的發病率明顯增高。在歐美某些國家和我國大城市中，肺癌的發病率已居男性各種腫瘤的首位,每年因肺癌死亡的人數超過100萬，并且每年新增病例120萬[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%，確診時多為晚期，盡管手術、化療、放療技術不斷提高，但NSCLC患者的預后仍很差，總體5年生存率低于20%[2]。miRNAs幾乎參與調節細胞的各個生物過程，包括發育、造血、器官形成、細胞凋亡、細胞增殖和腫瘤的發生、發展。在腫瘤組織中，miRNAs表達異常。MiRNAs既可起癌基因功能，又能作為抑癌因子。在肺癌組織中miRNAs有特定的表達譜，參與調節腫瘤血管生成等多個過程，并可作為生物標志物用以早期診斷，靶向治療及臨床預后。本文就miRNA的結構和生物學特性，在肺癌中的研究進展綜述如下。

1 miRNA的發現

1993年，Lee、Feinbaum和Ambros等發現在線蟲體內存在1種RNA(lin-4)，是1種不編碼蛋白但可以生成一對小的RNA轉錄本，每一個轉錄本能在翻譯水平通過抑制1種核蛋白lin-14的表達而調節了線蟲的幼蟲發育進程。7年后科學家又發現了第2個miRNA-let-7，let-7相似于lin-4，同樣可以調節線蟲的發育進程，Let-7最早在G.elegans體內發現。在線蟲C.elegan中，Let-7具有調控發育的時序及細胞增殖，在哺乳動物中也發現相同功能的基因，表明miRNA 進化上是比較保守的。

2 miRNA的產生及作用機制

miRNA通常是在細胞核內由RNA聚合酶Ⅱ轉錄的，在核內編碼miRNA的基因首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉錄成具有莖環結構的初級產物miRNA(pri-miRNA)。初級產物miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下形成由70個核苷酸組成的miRNA前體。轉運蛋白5將miRNA前體輸送到細胞質中。隨后，另一個核酸酶Dicer將其剪切，產生約為22個核苷酸長度的雙鏈miRNA。成熟miRNA 可形成RNA誘導沉默復合物(RISC)。miRISC依據miRNA與同源mRNA堿基互補配對的程度而啟動不同的作用機制，對完全配對的2個序列，miRISC對靶mRNA 進行剪切，對部分配對的2個序列，miRISC阻斷mRNA 的翻譯并降解mRNA，從而產生基因沉默。miRNA 不僅可引起轉錄后基因沉默，而且可引起轉錄前和轉錄期間的多重沉默[3]。

3 miRNA與肺癌的關系

3.1 miRNA與肺癌的發生和機制

肺癌中miRNA的作用模式(與miRNA相連的實線表示下調作用，虛線表示上調作用)

3.1.1 癌基因或抑癌基因 miRNA具有組織特異性，與肺組織相關的包括let-7a、miR-34、miR-21、miR-143、miR-145、miR-31、miR-146等40余種[4]。最近研究[5]證明，miRNAs與多種腫瘤的發生、發展密切相關。miRNA既可作為抑癌基因(miR-15a、miR-16-1、let-7等)下調原癌基因的活性；也可作為癌基因(miR-155，miR-17-5p，miR-21等)下調抑癌基因的活性。Johnson等發現let-7miRNA與RAS的3'端相結合，使人類細胞中RAS表達下降，與正常肺組織相比，let-7在肺癌組織中呈低表達。在肺腺癌細胞中恢復胞內let-7水平抑制了腫瘤細胞的生長，從而表明let-7可能在腫瘤發展過程中具有抑癌基因作用。Garofalo 等[6]在NSCLC 的研究中證實，miR-221 和miR-222 的表達水平在TNF 相關凋亡誘導配體( TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)抵抗的NSCLC 細胞中升高。

3.1.2 DNA甲基化 DNA甲基化是最早發現的表觀遺傳學修飾途徑之一，基因組甲基化受DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的調控。DNA甲基化能引起染色質結構改變，影響DNA構象及DNA穩定性，還能使DNA與蛋白質相互作用方式發生改變，從而調控基因表達。MiR-370 作用于白介素-6(IL-6)，受DNA甲基化酶1 及HASJ4442 的影響，而miR-34b 及miR-34c 由于甲基化不足，影響p53 相關基因的功能[7]。Fabbri等[8]研究發現，miR-29在肺癌組織中表達降低，并且miR-29 的表達量與DNMT3A 和DNMT3B呈負相關。在肺癌細胞中miR-29抑制兩者表達，可防止DNA過度甲基化，因此，miR-29可使抑癌基因去甲基化而正常表達，從而抑制腫瘤生長。

3.1.3 血管生成 癌細胞的生長、轉移依賴新生血管的形成，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最有效的促血管生長因子。腫瘤細胞能分泌VEGF等促血管生長因子，誘發血管內皮細胞增殖，逐步形成新生血管。Fish等[9]發現內皮細胞中高表達的miR-126調節內皮細胞對VEGF的反應。剔除斑馬魚體內的miR-126后將導致胚胎發育過程中血管完整性的降低及出血。增加Spred-1表達或抑制VEGF均得到與剔除miR-126類似的結果。此外，Liu等[10]研究發現miR-126在肺癌組織中低表達，將miR-126轉染到肺癌細胞后，發現miR-126可下調VEGF的表達并抑制肺癌細胞的增殖。隨后將穩定表達miR-126的肺癌細胞皮下注人裸鼠體內，與對照組相比，實驗組的腫瘤生長得到明顯抑制。有證據表明miRNA在某些腫瘤類型中起著調節RTKs的作用。EGFR在一些腫瘤類型中如肺癌中過表達，因此，在肺癌或者其他惡性腫瘤中利用針對EGFR的靶向藥物來抑制其活動。

3.2 miRNA與肺癌的早期診斷

正常組織和腫瘤組織中miRNAs表達明顯改變，且miRNAs在不同腫瘤中具有特定的表達模式，miRNAs在腫瘤中表達的這些特點為肺癌的診斷開辟了一條嶄新途徑，并且已經在包括肺癌在內的多種惡性腫瘤中得到證實[11]。

Wei等[12]應用RT-PCR 法，研究63例NSCLC患者和30例健康對照組血漿中的miR-21 表達情況，NSCLC患者的血漿miR-21 水平明顯高于年齡、性別匹配的對照組。Liang的研究表明miR-34b/34c/449在肺腺癌中陽性檢測率為87%，鱗狀細胞癌為82%[13]。Yanaihara 等[14]共發現6 種miRNAs( miR-205、- 99b、- 203、- 202、- 102 和- 204-pre)在肺腺癌和肺鱗癌中的表達存在顯著差異這些研究表明，miRNAs可能是以正常組織生理活性為背景診斷惡性生長的1種有效工具。另外發現，miRNA表達與細胞分化水平相關。Mascaux等[15]利用熒光支氣管鏡活檢正常組織、異常增生、原位癌、浸潤性鱗癌等不同病理過程組織，發現miR-32、miR-34c表達呈線性下降，miR-142-3p、miR-9則上升。

循環中miRNAs對于腫瘤診斷的效用也得到了研究，突出了它們作為腫瘤檢測的非侵入性診斷工具的潛能。一項研究對肺癌及結腸癌患者中特定的血清miRNA表達譜進行了鑒定，而且miR-25和miR-223在一個75例健康捐贈者及152例非小細胞肺癌患者的獨立實驗中得到了驗證，提示miR-25和miR-223可以作為非小細胞肺癌的診斷標識物[16]。有報道稱其他miRNAs如miR-141和miR-21分別對前列腺癌的發生具有預測作用并可作為診斷B細胞淋巴瘤的生物學標志物[17]。

Let-7a miRNA在NSCLC細胞和組織中有異常表達已被證實。Chen等[18]發現血清中包括let-7在內的miRNA水平穩定，重現性好，其血清水平可較好地指示包括癌癥在內的多種疾病，可以作為潛在的生物標志物檢測各種癌癥和其他疾病。Jeong 等[19]應用RT-PCR 方法分析35 例NSCLC 患者和30 名健康對照組血清中的let-7a 表達情況，發現NSCLC 患者的let-7a 表達水平明顯低于健康對照組； 而且血清學let-7a 低表達者腫瘤組織中的let-7a 水平也呈低表達。

3.3 miRNA與肺癌的治療

對由miRNAs調節的復雜網絡進行深入研究將有助于鑒定其他用于預測現行治療方法的miRNAs，并為臨床醫生對患者進行分層并將個性化治療方案最優化提供額外的工具。

放療是目前肺癌治療的常用方法之一。Weidhaas等[20]在體外培養的肺癌細胞和線蟲體內過表達let-7，發現其輻射敏感性增高，輻射誘導的細胞死亡增多；而降低let-7水平則產生輻射抵抗。Shin 等[21]在分析電離輻射后A549 細胞中miRNAs表達變化后證實，A549 細胞接受20 Gy和40 Gy放射后，miRNAs分別有4 種和10 種改變，并且這些變化的miRNAs與放射引起的細胞凋亡、細胞周期調控等有關。

靶向療法的出現意味著特殊肺癌亞型的分子分類可以進一步指導個體化治療模式并改善患者的預后。Bertino 等[22]提出了"miRNAs的藥物基因組學"的概念。拮抗miRNA(antagomir)是一類治療性RNA 分子，其功能是抑制miRNA的發揮作用。如用antagomir-17-5p 給藥2周，30% 的腫瘤得到徹底抑制[23]。用1種miRNA抑制劑antagomir[24]處理致瘤性miR-17-5p導致30%的小鼠發生完全的腫瘤衰退[23]。在小鼠和靈長類動物的其他研究結果表明，使用鎖核酸替換抑制劑可以有效地沉默miR-122，而且膽固醇結合也沒有證據表明治療相關的細胞毒作用[25]，支持這些方法在臨床應用中的發展。大量研究[26]已經表明，表皮生長因子受體( epidermal growth factor receptor，EGFR) 過度表達和( 或) 激活與NSCLC 患者生存期短及預后差及放化療敏感性下降密切相關，EGFR 與miRNAs間的關系已經成為肺癌研究的一大熱點。

針對miRNAs的作用機理開發肺癌特異性的治療藥物，在一些研究實驗中顯示了令人鼓舞的效果，不同于miRNA變種DNA，miRNA抑制劑不被miRNA的生物通路處理。這些抑制劑化學性的改變單股寡核苷酸對成熟miRNA的互補。這種化學修飾包括硫代硫酸、2'-O-甲基化[27]和鎖核酸替換增加了它們對核酸酶降解作用的耐受。這些抑制劑可以結合到RISC復合體中成熟的miRNA并作為競爭性抑制劑發揮作用，但也可以結合pri-miRNA 或pre-miRNA并消除它們的加工，從細胞核出來或結合到RISC復合體?？偠灾趍iRNA的治療方法具有巨大但未實現的潛能。

3.4 miRNA與肺癌的預后和轉移判斷

miRNAs主要參與腫瘤的發生和發展，提示這些調節因子可能對于獲取診斷及預后信息有特別的作用。當前研究表明，經miRNA譜分析的腫瘤與正常組織相比，具有不同的miRNA表達[28]，且認為miRNA可作為肺癌預后判斷指標。Yu等[29]對112 例NSCLC 患者進行檢測，通過Cox 模型和風險評分發現了5 個預測NSCLC 治療效果的miRNA 信號。一項在肺癌中的研究表明mir-155高表達及let-7a-2低表達與患者預后有關[30]。一項143例肺癌切除患者的獨立研究表明let-7的低表達的患者生存期顯著縮短，而與肺癌的分期無關[31]。

一些其他類型的miRNAs也可能具有診斷及判斷預后的價值。這些miRNAs包括保護性let-7和miR-221以及高危險的miR-137、miR-372和 miR-182，它們可以用于預測肺癌患者生存的可能性。Gallardo 等[32]分析了70 例NSCLC 患者的腫瘤組織，發現miR-34 家族在腫瘤組織中表達下調且與術后復發率高有關。多項研究結果表明大多數保護性的miRNAs在肺癌中的表達通常是下調的，而與高風險有關的miRNAs的表達往往上調[33]，這種miRNAs的差別表達可能具有診斷意義及判斷預后的價值。Hu等[34]最近研究報道基于Solexa 測序方法在血清中檢測出的4 種miRNAs組合( miR-486、-30 d、-1 和-499) 能夠準確預測Ⅰ至Ⅲa 期NSCLC 患者的預后。

關于miRNA的研究日趨成熟，問題正由miRNA是否在腫瘤中區別表達轉向miRNA是否具有治療效用。人類腫瘤譜已經鑒定出與風險、診斷、預后和治療反應相關的標記。與正常組織相比惡性腫瘤細胞中高度保守的非編碼基因的區別表達為疾病的進展提供更好的理解。目前尚無系統研究miRNA與肺癌的發生發展的關系，miRNA 與基因表達調控方式的精細調節機制還不清楚，miRNA在細胞生長發育中的作用機理亦不清楚，這一領域正進入系統生物學，通過它們相互作用及功能把我們從單一miRNAs及一種或幾種主要靶點的研究帶入對調節網絡更全面的探索，并將miRNAs整合到已存在的信號通路、代謝、蛋白質相互作用及基因調節網絡。

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