革蘭氏陽性菌和陰性菌對山梨酸鉀的耐受差異性

滕 菲， 郭桂萍， 趙 勇， 潘迎捷， 盧 瑛＊

（1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.江蘇南通出入境檢驗檢疫局，江蘇 南通 226000）

革蘭氏陽性菌和陰性菌對山梨酸鉀的耐受差異性

滕 菲1， 郭桂萍2， 趙 勇1， 潘迎捷1， 盧 瑛＊1

（1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.江蘇南通出入境檢驗檢疫局，江蘇 南通 226000）

對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌對山梨酸鉀防腐劑的耐受性差異進行了探討。以食品中常見的革蘭氏陽性菌（蠟樣芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌）與革蘭氏陰性菌（沙門氏菌、副溶血弧菌、熒光假單胞菌）為研究對象，針對純培養狀態和模擬食品體系進行了研究。結果顯示，加入1 g／L山梨酸鉀后革蘭氏陰性菌的菌數可減少近102～103.5CFU／m L，而革蘭氏陽性菌的菌數只能減少近10 CFU／m L，說明山梨酸鉀對革蘭氏陰性菌的抑菌效果比革蘭氏陽性菌要高2倍以上。最小抑菌濃度實驗和即食海帶的接種模擬實驗結果與生長曲線結果相吻合，顯示革蘭氏陽性菌對山梨酸鉀的耐受性強于革蘭氏陰性菌，此結果對于今后應用山梨酸鉀進行革蘭氏陽性菌類的防控具有重要意義。

革蘭氏陽性菌；革蘭氏陰性菌；耐受性；山梨酸鉀

食源性疾病是發展中國家和發達國家的首要食品安全問題，對人類健康危害嚴重，尤其是對兒童、孕婦和老人。食品在生產和貯藏過程中，易受細菌性微生物感染而腐敗變質，并導致食物中毒和食源性疾病影響人類健康。采用防腐劑抑制腐敗菌與食源性致病菌是貯藏食品的有效手段之一［1］。常見的食源性致病菌種類繁多，其中包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。目前水產品中的主要防腐劑有山梨酸鉀，山梨酸，二氧化氯水溶液等［2］。山梨酸鉀作為一種不飽和脂肪酸，可在體內參與新陳代謝，最終被分解成二氧化碳和水，而幾乎沒有毒性［3］，目前山梨酸鉀已成為一種在全球范圍使用廣泛的化學防腐劑。

金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌是革蘭氏陽性菌，在環境中分布廣泛［4－5］，兩者在我國水產品中都曾有報道被檢出［4，6－7］。副溶血弧菌是一種革蘭陰性嗜鹽桿菌，主要分布于沿岸海水、海河交界處及海產品中，是沿海地區引起食物中毒的重要病原菌，在海產品上的帶菌率高達45.7%［8］。有報道稱這3種菌引起的食物中毒事件近年來呈上升趨勢［9］。沙門氏菌是革蘭氏陰性無芽抱桿菌，是我國進口水產品致病菌檢測中的必檢項目［10］。作者選取這4種菌以及食品中常見的蠟樣芽孢桿菌和熒光假單胞菌作為實驗對象，對純培養狀態和模擬食品體系中的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌對山梨酸鉀防腐劑的耐受性差異進行了探討，以期為今后制定更有針對性的食品防控措施提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料山梨酸鉀（食品添加級）：購自珠海市悅發食品有限公司；菌株：購于ATCC；培養基：胰蛋白胨大豆肉湯和胰蛋白胨大豆瓊脂（TSB，TSA）：均購于中國檢驗檢疫科學研究院北京陸橋技術有限責任公司；即食海帶（1 k G真空包裝）：上海揚騏工貿有限公司所贈。

1.1.2 主要儀器與設備隔水式恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司產品；分析天平：梅特洛－托利多公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化及菌懸液制備菌種于－80℃冰箱中取出，取一環接種于5 m L TSB中，活化3次。

1.2.2 生長曲線實驗取500μL活化3次后的菌液接種于100 m LTSB的三角燒瓶中，37℃、170 r／min轉搖床培養至菌數為103CFU／m L時加入山梨酸鉀。于37℃培養箱中培養。加入的山梨酸鉀質量濃度為0.2，1，2，4 g／L，另取一組未加山梨酸鉀的培養基做為對照組，每個質量濃度做3個平行。持續培養，每小時取樣品進行平板記數。

1.2.3 最小抑菌濃度（MIC）實驗參考 Millette等人的試驗方法［12］，首先將山梨酸鉀溶于TSB中，二倍梯度稀釋，取各梯度稀釋液0.1 m L注入無菌的96孔培養板中。然后每個孔中加入5×105CFU／mL指示菌，實際實驗中山梨酸鉀的最終質量濃度為600，300，150，75，37.5，15.75 g／L。另外取一組未接指示菌的山梨酸鉀梯度液作為陰性對照。將96孔板蓋上無菌膜放于37℃培養24 h。然后于96孔酶標儀600 nm下測定吸光值。樣品孔指示菌的A600值與陰性對照組有明顯差異時的濃度視為最小抑菌濃度。

1.2.4 接種海帶實驗取新鮮出廠的真空包裝即食海帶樣品，用體積分數95%乙醇浸泡30 min，無菌水洗3次備用，此時海帶的帶菌量小于5 CFU／mL，吸取103CFU／mL活化3次后的各菌液分別滴加到盛有25 g酒精處理后海帶的無菌培養皿中，置于37℃恒溫培養箱中培養。參考食品添加標準GB2760－1996系列中針對即食海帶的規定［11］，加入1 g／L山梨酸鉀溶液；另取一組未加山梨酸鉀的酒精處理后海帶做為對照組，每個質量濃度做3個平行。持續培養24 h，每4 h取樣品進行平板記數。

2 結果與分析

2.1 生長曲線結果

由圖1可見，蠟樣芽孢桿菌組中加入山梨酸鉀后，在進入生長平衡期時（8 h），加入1 g／L山梨酸鉀時菌數比對照組減少了近10 CFU／m L，加入2，4 g／L山梨酸鉀時比對照組減少了近100 CFU／m L。對于金黃色葡萄球菌組，在培養4 h后可觀察到較明顯變化：加入1，2 g／L山梨酸鉀組其菌數比對照組減少了近100.5CFU／m L，加入4 g／L山梨酸鉀時菌數比對照組減少了約10 CFU／m L。對于單增李斯特菌組，培養20 h后，加入了1、2 g／L山梨酸鉀組的菌數比對照組減少了近10 CFU／m L，而加入了4 g／L山梨酸鉀組的菌數則比對照組減少了近100 CFU／m L。國標中規定的山梨酸鉀最大加入量為1 g／L，上述3種菌在此濃度時的菌數與對照組相比，都減少了約10 CFU／m L。上述結果顯示，山梨酸鉀對蠟樣芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌有一定的抑制作用。

圖1 致病菌在不同山梨酸鉀質量濃度下的生長曲線圖Fig.1 Effect of potassium sorbate concentration on the growth curves of three gram positive bacteria

圖2 致病菌在不同山梨酸鉀質量濃度下的生長曲線圖Fig.2 Effect of potassium sorbate concentration on the growth curves of three gram negative bacteria

由圖2可知，沙門氏菌組中加入了1 g／L山梨酸鉀后生長平衡期（10 h）的菌數比對照組減少了100 CFU／m L，加入4 g／L山梨酸鉀組則減少了將近103.5CFU／m L。副溶血弧菌組在培養6 h后，加入0.2 g／L山梨酸鉀后即比對照組減少了近101.5CFU／m L，加入1 g／L 山梨酸鉀后減少了近103.5CFU／m L，加入4 g／L山梨酸鉀后的菌數比對照組減少了近104CFU／m L。對于熒光假單胞菌，加入0.2 g／L山梨酸鉀后在生長平衡期（10 h）的菌數比對照組減少了近10 CFU／m L，加入1 g／L山梨酸鉀后減少了近100 CFU／m L，加入了4 g／L山梨酸鉀后的平臺期菌數比對照組減少了近103CFU／m L。綜上所述，上述3種菌在加入了國標所規定的最大質量濃度1 g／L山梨酸鉀時，與對照組相比，平臺期的菌數減少了102～103.5CFU／m L。由此可見，山梨酸鉀對沙門氏菌、副溶血弧菌、熒光假單胞菌3種菌的抑制作用較強。

2.2 最小抑菌濃度（MIC）實驗結果

由表1可見，山梨酸鉀對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的最小抑菌濃度最高，達到600 g／L，對單增李斯特次之，為300 g／L，對熒光假單胞最低，僅為37.5 g／L，對副溶血弧菌次之，為75 g／L。雖然山梨酸鉀對沙門氏菌的最小抑菌濃度與單增李斯特菌相同，但山梨酸鉀對革蘭氏陽性菌的最小抑菌濃度（300 g／L）整體高于革蘭氏陰性菌 （150 g／L）。這與前面的生長曲線結果相吻合。

表1 山梨酸鉀對革蘭氏陽性菌和陰性菌的抑菌效果Tab.1 Effects of potassium sorbate concentration of growth of gram positive and negative bacteria

2.3 即食海帶接種實驗結果

由圖3可知，金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌接種到即食海帶中后，山梨酸鉀組的生長曲線與對照組基本重合，并同時達到生長平衡期。上述結果說明1 g／L山梨酸鉀對這兩種革蘭氏陽性菌的生長基本上沒有抑制作用。

圖3 即食海帶中革蘭氏陽性菌的生長曲線圖Fig.3 Growth curves of two gram positive bacteria inoculated to instant kelp

由圖4可知，沙門氏菌和副溶血性弧菌接種到即食海帶中后，在生長平衡期（16～20 h），這兩種菌的山梨酸鉀加入組的菌數比對照組減少了近10 CFU／m L，結果顯示1 g／L山梨酸鉀對沙門氏菌和副溶血性弧菌有一定的抑制作用。

圖4 即食海帶中革蘭氏陰性菌的生長曲線圖Fig.4 Growth curves of two gram positive bacteria inoculated to instant kelp

3 結語

選用了3種革蘭氏陽性菌（分別為蠟樣芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌）和3種革蘭氏陰性菌（分別為沙門氏菌，副溶血弧菌和熒光假單胞菌），探討了食品工業中常用的防腐劑山梨酸鉀對這些菌的抑菌效果。不同山梨酸鉀質量濃度下的生長曲線結果顯示，加入1 g／L山梨酸鉀后，革蘭氏陰性菌的菌數可減少近102～103.5CFU／m L，而革蘭氏陽性菌的菌數只能減少近10 CFU／m L，即山梨酸鉀對革蘭氏陰性菌的抑菌效果比革蘭氏陽性菌要高2倍以上。最小抑菌濃度結果和即食海帶的接種模擬實驗結果也顯示出革蘭氏陽性菌對山梨酸鉀的耐受性要高于革蘭氏陰性菌，與生長曲線結果相吻合。研究顯示，山梨酸鉀需要通過微生物細胞膜進入細胞內，造成胞內p H值降低而抑制細胞的基本代謝反應。山梨酸鉀具有親脂性［14］，革蘭氏陰性菌的細胞壁脂類物質含量較高，因此山梨酸鉀分子易通過；革蘭氏陽性菌的細胞壁則含有大量肽聚糖，不易通過。因此，作者認為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌細胞壁的結構差異可能是造成兩者對山梨酸鉀耐受性差異的主要原因。

山梨酸鉀在食品工業中作為防腐劑應用范圍十分廣泛，在很多食品中的使用質量濃度不得超過1 g／L，研究顯示，蠟樣芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌這些革蘭氏陽性菌在37℃時對高于此規定質量濃度的山梨酸鉀仍有一定的耐受性，具有較好的生長趨勢。這說明即便是添加了山梨酸鉀防腐劑，一旦在食品供應銷售過程中其貯藏或保存條件不當時，這些菌還是具備大量繁殖能力，即還存在著食品安全的隱患。因此，在應用山梨酸鉀防腐劑時，對于革蘭氏陽性菌類應予以特殊重視并多管齊下進行控制為宜。

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Study of the Tolerance Difference between Gram Positive and Gram Negative Bacteria to Potassium Sorbate

TENG Fei1，GUO Gui－ping2，ZHAO Yong1，PAN Ying－jie1，LU Ying＊1

（1.College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Nantong Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nantong 226000，China）

In this study，the tolerance of 3 gram positive（Bacillus cereus，Staphylococcus aureusandListeria monocytologene）and 3 gram negative bacteria（Vibrio parahaemolyticus，SalmonellaandPseudomonas fluorescens）topotassium sorbate were carefully studied by pure cultivation and simulation of food system.When 1 g／L potassium sorbate was presented in culture，the number of gram negative bacteria was reduced to up to 2～3.5 lg（CFU／m L），while those of gram positive bacteria were only reduce to 1 lg（CFU／m L）.This results demonstrated potassium sorbate inhibited on the gram negative bacteria growth than that of the gram negative bacteria.Results of pure culture，minimal inhibitory concentration（MIC）and inoculation to instant kelp results all showed that the tolerance of gram positive bacteria is better than gram negative bacteria.It may have significance in the application of potassium sorbate on the control of gram positive bacteria.

gram positive，gram negative，tolerance，potassium sorbate，innoculation

＊

盧瑛（1971－），女，浙江東陽人，理學博士，副教授，碩士研究生導師，主要從事食品生物技術方面的研究。Email：y－lu＠shou.edu.cn

TS 201.6

A

1673－1689（2012）04－0417－06

2010－12－21

上海市科技興農重點攻關項目（滬農科攻字（2009）第6－1號）；上海市教育委員會科研創新項目（09YZ274）；江蘇出入境檢驗檢疫局科研項目（2010KJ34）；上海市教育委員會重點學科建設項目（J50704）。