金銀花飲片和金銀花現代飲片RP-HPLC指紋圖譜對比研究

李 文，易進海，劉 芳，唐小龍

(1.瀘州醫學院藥學院，四川瀘州 646000;2.四川省中醫藥科學院，四川成都 610041; 3.成都中醫藥大學藥學院，四川成都 610075)

0 引言

金銀花(Flos Lonicerae Japonicae)為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb)的干燥花蕾或帶初開的花，其性味甘寒，歸肺、心、胃經，具有清熱解毒、涼散風熱等功能，常用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發熱諸癥［1］.金銀花現代飲片是根據“中藥煮散”理論而研發的新型中藥飲片，其目的是在不改變金銀花藥性、藥效的同時，盡可能減少飲片的劑量和煎藥時間，以提高中藥飲片的利用率［2］.本研究通過對金銀花飲片和金銀花現代飲片RP-HPLC指紋圖譜的對比研究，分析兩者品質是否存在差異，進而為金銀花現代飲片的臨床應用提供實驗依據.

1 儀器、藥材與試藥

1.1 儀 器

實驗所用儀器包括:Agilent 1200型高效液相色譜儀(包括四元泵、DAD檢測器、柱溫箱、自動進樣器、工作站)，Agilent Eclipse XDB C18色譜柱(250× 4.6 mm，5 μm)，AUW220D型電子天平(日本島津公司)，KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Millipore Milli-Q Integral 3超純水機，3K15高速離心機(德國Sigma公司).

1.2 藥 材

實驗所用藥材包括:不同產地的金銀花飲片，并由成都中醫藥大學中藥鑒定與藥用植物學教研室蔣桂華教授鑒定為忍冬科多年生半常綠木質藤本忍冬的干燥花蕾或帶初開的花;金銀花現代飲片為本實驗室自制(取金銀花粗粉，按0.2 mL/g均勻噴水，充分混勻后制得軟材，塑制法擠壓成型，中低火微波(750 W，頻率2 450 MHz)干燥4 min，取出即得.

1.3 試 藥

實驗所用試藥包括:綠原酸對照品(批號，110753－200413，中國藥品生物制品檢定所)，甲醇為色譜純(Fisher公司)，超純水，其他試劑均為分析純.

2 方法與結果

2.1 色譜條件

實驗所用的色譜條件為:色譜柱，Eclipse XDB C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，A相為0.4%磷酸溶液，B相為乙腈;梯度洗脫程序為，0～20 min (97%～90%A)，20～45 min(90%～76%A)，45～55 min(76%～60%A)，55～60 min(60%～97% A);檢測波長238 nm，色譜柱溫度35℃，流速1.0 mL/min，運行時間60 min.

2.2 參照物溶液制備

參照物溶液的制備方法為:取綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成0.0394 mg/mL的對照品溶液.

2.3 供試品溶液制備

供試品溶液的制備方法為:取金銀花飲片粗粉0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，浸泡20 min，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足損失的重量，搖勻，高速離心(12 000 rpm)5 min，取上清液，供HPLC分析用.另外，取金銀花現代飲片粗粉約0.5 g，同法制備金銀花現代飲片供試品溶液.

2.4 色譜指紋圖譜實驗方法學驗證

2.4.1 專屬性考察.

分別取甲醇溶液和綠原酸對照品溶液注入高效液相色譜儀進行分析，其圖譜如圖1所示.

圖1 甲醇圖譜(A)和綠原酸圖譜(B)

由圖1可知，綠原酸的保留時間約為22 min，且甲醇在對照品保留時間一致的位置上無吸收峰，說明本實驗的專屬性良好.

2.4.2 儀器精密度.

取同一份供試品溶液，連續進樣6次，以綠原酸的峰面積計算其RSD(%)為0.50，其全譜的相似度(中位數相關系數法)分別為，0.999、0.999、0.997、0.999、0.997、0.998.實驗結果表明，儀器精密度良好.

2.4.3 穩定性.

取同一份供試品溶液，分別于，0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，進樣，以綠原酸的峰面積計算其RSD (%)為0.78，其全譜的相似度(中位數相關系數法)分別為，0.999、0.998、0.997、0.999、0.996、0.998.實驗結果表明，樣品在24h內穩定.

2.4.4 重復性.

取同一批號的供試品5份，按供試品溶液的制備和檢測方法進行測定，以綠原酸的峰面積計算其RSD(%)為1.36，其全譜的相似度(中位數相關系數法)分別為，0.995、0.991、0.995、0.993、0.990.實驗結果表明，方法的重復性良好.

2.5 色譜指紋圖譜建立和辨認

2.5.1 色譜峰的定位和參照物的選擇.

通過對照品實驗，鑒別金銀花HPLC指紋圖譜第2號色譜峰為綠原酸，該峰為指紋圖譜中峰面積積分值最大、最穩定的一個峰.此外，綠原酸為2010年版《藥典》(一部)金銀花項下規定的指標成分［3］，故本研究選擇綠原酸作為參照物.

2.5.2 共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積.

從10批金銀花飲片HPLC圖譜的15個色譜峰中，選擇9個峰作為共有色譜峰.共有色譜峰的相對保留時間如表1所示，相對峰面積如表2所示.

表1 10批金銀花飲片共有色譜峰相對保留時間

表2 10批金銀花飲片共有色譜峰相對峰面積

從表1和表2數據可知，10批金銀花飲片共有色譜峰相對保留時間的RSD(%)＜3.

同樣，從10批金銀花現代飲片HPLC圖譜的15個色譜峰中，選擇9個峰作為共有色譜峰.共有色譜峰的相對保留時間見表3，相對峰面積見表4.

表3 10批金銀花現代飲片共有色譜峰相對保留時間

表4 10批金銀花現代飲片共有色譜峰相對峰面積

從表3和表4數據可知，10批金銀花現代飲片共有色譜峰相對保留時間RSD(%)＜3.

2.5.3 相似度評價.

相似度評價采用國家藥典委員會編制的2004A版“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”分析軟件，計算10批金銀花飲片和金銀花現代飲片的相似度，結果如圖2所示.

圖2 10批金銀花飲片指紋圖譜(A)和10批金銀花現代飲片指紋圖譜(B)

計算數據表明:10批金銀花飲片的相似度依次為，0.980、0.943、0.983、0.994、0.993、0.994、0.949、0.985、0.918、0.995;10批金銀花現代飲片的相似度依次為，0.989、0.995、0.978、0.937、0.995、0.993、0.989、0.995、0.918、0.920.實驗結果表明，10批金銀花飲片與10批金銀花現代飲片其相似度均大于0.90，具有較高的相似度.經軟件處理，本研究得到的金銀花飲片和金銀花現代飲片共有模式如圖3所示.

圖3 10批金銀花飲片共有模式(A)和10批金銀花現代飲片共有模式(B)

3 討論

在研究過程中，我們通過查閱文獻，并經比較后確定本實驗的色譜條件［4－7］為:采用乙腈—0.4%磷酸水溶液二元梯度法，A相為0.4%磷酸溶液，B相為乙腈;梯度洗脫程序為，0～20 min(97%～90% A)，20～45 min(90%～76%A)，45～55 min(76%～60%A)，55～60 min(60%～97%A);檢測波長238 nm，色譜柱溫度35℃，流速1.0 mL/min，運行時間為60 min.在該色譜條件下，金銀花飲片和金銀花現代飲片中各組分得到較好地分離，并且在60 min內各組分全部出峰.

金銀花現代飲片是根據“中藥煮散”理論研發的新型中藥飲片，其飲片的使用量和煎藥時間與傳統飲片相比明顯減少，中藥飲片的利用率顯著提高，且其指紋圖譜與金銀花飲片的指紋圖譜無明顯差異.實驗表明，金銀花現代飲片具有較好的發展及應用前景.

［1］張廷模.中藥學［M］.北京:高等教育出版社，2002.

［2］孫守祥.中藥湯劑的歷史發展與未來改進探討［J］.時珍國藥研究，1997，8(2):169－170.

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