對成都地區10株黏細菌菌株酶活性的初步研究

劉冰花，羅亞雄，曾玉桂，謝小英，饒 停，陳 娟，張艷萍

(成都大學醫護學院，四川成都 610106)

0 引言

目前，酶廣泛應用于醫藥、生物燃料、傳統釀造、食品加工、紡織、造紙、皮革及有機合成等領域，酶的提取和合成已成為科研人員重要的研究課題［1－3］.酶可以從動植物體內提取，但由于酶在生物體內的含量很低，并且從動植物體內提取酶的成本較高，在工業上目前主要通過微生物發酵的方法生產酶.黏細菌(myxcobacteria)是產子實體的滑行細菌，屬于原核生物，具有復雜的社會行為和生活周期［4］.同時，黏細菌可產生豐富的次級代謝物，是人們獲得大量天然藥物和酶的重要來源［5］.本研究擬從黏細菌中尋找具有工業價值的酶類.

1 材料

1.1 實驗菌株

實驗所用黏細菌菌株來自成都地區并由本實驗室分離并保藏，菌株編號分別為，CL-1、CL-3、CL-5、CH-1、CH-2、CC-1、CY-1、CX-1、CL-7和CM-2.

1.2 培養基

(1)VY/4培養基［6］.安琪酵母0.25%，CaCl2· 2H2O 0.1%，維生素 B120.5 μg·mL－1，瓊脂粉1.50%，pH值7.2.

(2)纖維素酶活性鑒別培養基.微晶纖維素0.5%，安琪酵母0.2%，K2HPO4·3H2O 0.15%， KH2PO40.1%，NaCl 0.05%，無水CaCl20.01%，維生素B120.5 μg·mL－1，瓊脂粉1.5%，pH值7.2.

(3)淀粉酶活性鑒別培養基.可溶性淀粉0.5%，安琪酵母0.2%，K2HPO4·3H2O 0.15%，KH2PO40.1%，NaCl 0.05%，無水CaCl20.01%，維生素B120.5 μg·mL－1，瓊脂粉1.5%，pH值7.2.

(4)蛋白酶活性鑒別培養基.酪蛋白0.25%，K2HPO4·3H2O 0.15%，KH2PO40.1%，NaCl 0.05%，無水CaCl20.01%，維生素B120.5 μg·mL－1，瓊脂粉1.5%，pH值7.2.

(5)殼聚糖酶活性鑒別培養基.A液，殼聚糖1.0%，pH值7.2.B液，安琪酵母0.4%，K2HPO4· 3H2O 0.30%，KH2PO40.2%，NaCl 0.10%，無水CaCl20.02%，瓊脂粉3.0%，pH值7.2.A液、B液分別于121℃滅菌20 min，待A液、B液冷卻至50℃左右時進行1∶1混合，同時加入維生素B12至0.5 μg·mL－1.

(6)脂肪酶活性鑒別培養基.Tween 80 1.0%，安琪酵母0.2%，K2HPO4·3H2O 0.15%，KH2PO40.1%，NaCl 0.05%，無水CaCl20.01%，維生素B120.5 μg·mL－1，瓊脂粉1.5%，pH值7.2.

2 方法

2.1 10株黏細菌菌株纖維素酶活性初步檢測

將10株黏細菌菌株分別接種于纖維素酶活性鑒別培養基平板上，30℃恒溫保濕培養.38 h后取出，在每個平板上加入適量1 mg/mL剛果紅溶液染色1 h，然用1 mol/L的NaCl溶液脫色［7］.觀察是否有透明圈，并用游標卡尺測量透明圈的直徑.若菌株產纖維素酶，則在菌落周圍會出現清晰的透明圈，透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比(D/d)越大，其酶活性越高.

2.2 10株黏細菌菌株淀粉酶活性初步檢測

將10株黏細菌菌株分別接種在淀粉酶活性鑒別培養基平板上，30℃恒溫保濕培養.38 h后取出，在每個平板上加入適量的盧戈斯碘液染色，20 min后用蒸餾水洗去多余的碘液，觀察是否有透明圈，并用游標卡尺測量透明圈的直徑.有透明圈者則證明該株黏細菌可產生淀粉酶，透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比(D/d)越大，其酶活性越高.

2.3 10株黏細菌菌株蛋白酶活性初步檢測

將10株黏細菌菌株分別接種在蛋白酶活性鑒別培養基平板上，30℃恒溫保濕培養.觀察是否有透明圈及測量透明圈直徑大小.有透明圈者則證明該株黏細菌可產生蛋白酶，透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比(D/d)越大，其酶活性越高.

2.4 10株黏細菌菌株殼聚糖酶活性初步檢測

將10株黏細菌菌株分別接種在殼聚糖酶活性鑒別培養基平板上，30℃恒溫保濕培養.觀察是否有透明圈及測量透明圈直徑大小.有透明圈者則證明該株黏細菌可產生殼聚糖酶，透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比(D/d)越大，其酶活性越高.

2.5 10株黏細菌菌株脂肪酶和氧化分解脂肪酸的酶類活性初步檢測

將10株黏細菌菌株分別接種在脂肪酶活性鑒別培養基平板上，30℃恒溫保濕培養.觀察是否有白色沉淀圈和透明圈.產脂肪酶的菌株能水解Tween 80，并在菌落周圍形成白色沉淀圈［8］;既可產脂肪酶又可產生氧化分解脂肪酸的酶類的菌株不但能將Tween 80水解，而且還可將Tween 80的水解產物油酸氧化分解，其菌落周圍會出現透明圈.沉淀圈和透明圈直徑與菌落直徑之比越大，其酶活性越高.

3 結果

部分黏細菌菌株在相應的酶活性檢測平板上的透明圈或沉淀圈如圖1所示.

圖1 部分黏細菌菌株在特定酶活性檢測平板上的透明圈或沉淀圈

3.1 纖維素酶活性初步檢測結果

研究發現:10株黏細菌菌株均可在纖維素酶活性鑒別培養基平板上生長，染色前只有CL-1、CX-1 2個菌株的平板上有明顯的透明圈，其余菌株的平板上僅有模糊的透明圈或者沒有透明圈;用1 mg/ mL剛果紅溶液染色后，除了CC-1菌株的平板上沒有透明圈外，其余菌株的培養基平板上都有明顯的透明圈出現，用1 mol/L鹽酸脫色后，透明圈的邊界更明顯;脫色后各培養基平板上的菌落直徑(d)、透明圈直徑(D)及D/d之比如表1所示.

表1 10株黏細菌菌株在纖維素酶活性鑒別平板上的酶活性情況(38 h)

從表1數據可知，10株黏細菌菌株中只有菌株CC-1不產生纖維素酶，其余菌株均可產生纖維素酶，其中菌株CX-1的D/d之比為11.50，為最大，故菌株CX-1的纖維素酶活性最高.雖然菌株CY-1的透明圈直徑(D)最大，但由于菌株CY-1在平板上的菌落直徑(d)也較大，導致其D/d之比較小.

3.2 淀粉酶活性初步檢測結果

研究發現:除了菌株CC-1在淀粉酶檢測平板上沒有透明圈外，其余9株黏細菌菌株在淀粉酶檢測平板上均有明顯的透明圈;用盧戈斯碘液染色后透明圈的邊界更加明顯.各培養基平板上的透明圈直徑(D)、菌落直徑(d)及D/d之比如表2所示.

表2 10株黏細菌菌株在淀粉酶活性鑒別培養基平板上的酶活性情況(38 h)

從表2數據可知:除了菌株CC-1不產生淀粉酶外，其余9株黏細菌菌株均可產生淀粉酶，其中菌株CL-7的D/d之比為3.60，為最大，故菌株CL-7的淀粉酶活性最高;雖然菌株CL-3的透明圈直徑(D)最大，但由于菌株CL-3在平板上的菌落直徑(d)也較大，導致其D/d之比較小.

3.3 蛋白酶活性初步檢測結果

研究發現，10株黏細菌菌株的蛋白酶活性檢測平板上均有明顯的透明圈，各平板上的透明圈直徑(D)、菌落直徑(d)及D/d之比如表3所示.

表3 10株黏細菌菌株在蛋白酶活性鑒別培養基平板上的酶活性情況(39 h)

從表3數據可知:10株黏細菌菌株均可產生蛋白酶，其中菌株CC-1的D/d之比為5.50，為最大，故菌株CC-1的蛋白酶活性最高;菌株CY-1的D/d之比為1.15，所以菌株CY-1的蛋白酶活性最低;菌株CL-5的透明圈直徑(D)雖然最大，但由于菌落直徑(d)也最大，導致其D/d之比較小.

3.4 殼聚酶活性初步檢測結果

研究發現，菌株CL-1、CL-3、CX-1和CL-7的殼聚糖酶活性檢測平板上有明顯的透明圈，菌株CL-5、CH-1、CH-2的殼聚糖酶活性檢測平板上盡管有透明圈，但透明圈均比較模糊不清，菌株CC-1的殼聚糖酶活性檢測平板上完全沒有透明圈.各平板上的透明圈直徑(D)、菌落直徑(d)及D/d之比如表4所示.

表4 10株黏細菌菌株在殼聚糖酶活性鑒別培養基平板上的酶活性情況(42 h)

從表4數據可知，菌株CL-1的殼聚糖酶活性最高，菌株CL-3的殼聚糖酶活性僅次于菌株CL-1，菌株CC-1不產生殼聚糖酶，其他菌株的殼聚糖酶活性均較低.

3.5 脂肪酶活性初步檢測結果

研究發現:菌株CL-3、CL-5、CH-1、CH-2和CM-2的脂肪酶活性檢測平板上只有明顯的白色沉淀圈，無透明圈，說明這幾種菌株只產生脂肪酶，不產生氧化分解脂肪酸的酶類;菌株CL-1、CC-1和CY-1的脂肪酶活性檢測平板上只有明顯的透明圈，無白色沉淀圈，說明這些菌株不但將Tween 80上水解了，而且還將生成的油酸也氧化分解了，這些菌株既可產生脂肪酶又可產生氧化分解脂肪酸的酶類，并且氧化分解脂肪酸的酶類的酶活性遠遠大于脂肪酶的酶活性;菌株CX-1和CL-7的脂肪酶活性檢測平板上既有白色沉淀圈又有無色透明圈，說明這2種菌株產生的氧化分解脂肪酸的酶類的酶活性小于其產生的脂肪酶的酶活性.各平板上的白色圈直徑(D)、菌落直徑(d)及D/d之比、透明圈直徑(D')及D'/d之比如表5所示.

表5 10株黏細菌菌株在脂肪酶活性鑒別培養基平板上的酶活性情況(54 h)

從表5數據可知:菌株CL-5的脂肪酶活性最高，菌株CH-2的脂肪酶活性次之;菌株CL-1的D'/ d之比為9.00，故其具有極高的氧化分解脂肪酸的酶活性.

4 討論

本研究表明，實驗所選10株黏細菌菌株均可產生特定的高活性酶類，說明黏細菌不但是抗生素的重要來源，而且還可以在酶工業生產中發揮極大的作用.特別是菌株CC-1，其不產生纖維素酶、殼聚糖酶、淀粉酶，而只產生活性較高的蛋白酶和氧化分解脂肪酸的酶類，產酶種類比較單一，這為其進一步的酶的分離純化奠定了良好基礎.同時，研究還發現，菌株CC-1的次級代謝物具有溶栓活性和抗腫瘤活性，說明菌株CC-1具有極高的研究開發價值.

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