氨氮脅迫對刺參幾種免疫酶活性的影響

劉洪展, 鄭風榮, 孫修勤, 唐學璽, 董雙林

(1. 山東大學 威海分校, 山東 威海 264209; 2. 國家海洋局 第一海洋研究所, 山東 青島 266061; 3.中國海洋大學, 山東 青島 266003)

氨氮脅迫對刺參幾種免疫酶活性的影響

劉洪展1, 鄭風榮2, 孫修勤2, 唐學璽3, 董雙林3

(1. 山東大學 威海分校, 山東 威海 264209; 2. 國家海洋局 第一海洋研究所, 山東 青島 266061; 3.中國海洋大學, 山東 青島 266003)

以養殖刺參(Apostichopus japonicus)為研究對象, 對不同濃度的氨氮處理及病菌感染條件下刺參體腔液免疫酶的變化進行了測定。結果表明： 隨著氨氮處理強度的增加, 刺參體腔液中超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(ALP)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)及溶菌酶(LSZ)活性呈現先升高后降低的趨勢,而同時感染病菌的情況下, 較低質量濃度的氨氮脅迫可使SOD、GPX、ALP及LSZ活性上升, 但在較高濃度氨氮處理時, 酶活性的誘導則受到抑制。說明適宜濃度的氨氮處理可增強刺參的免疫力, 從而減輕病菌感染對刺參造成的免疫功能損傷和提高刺參抗病力。刺參在感染病原菌假交替單胞菌(Pseudoalte- romonassp)的條件下, 3 mg/L、4 mg/L和6 mg/L濃度的氨氮處理第6天, 刺參的累積發病死亡率分別為44.4%、55.6% 和72.2%, 高于對照組, 表明較高濃度的氨氮脅迫能夠顯著降低刺參的免疫力, 增加對病原菌的易感性。因此, 在刺參養殖過程中, 氨氮濃度的調控具有重要的意義。

氨氮脅迫; 刺參(Apostichopus japonicus); 體腔液酶; 免疫反應

氨氮是水產養殖中重要的水體環境污染指標。養殖水體中, 由于養殖動物的排泄和殘餌的氨化作用, 造成氨氮、硫化氫以及亞硝酸氮等有不斷積累,影響養殖生物的生長, 甚至發生毒害, 氨氮已成為水產養殖系統中最普遍的毒性物質。其中, 亞硝態氮是氨轉化成硝態氮過程的中間產物, 硝態氮是氨氮在水體中有氧環境下的最終產物, 可以被浮游植物直接吸收利用[1]。Cheng等[2]和 Wang等[3]的研究表明氨態氮和亞硝態氮污染是導致免疫能力降低、疾病發生的重要外部因子之一, 并可引起生理生化因子、組織結構及免疫抗病能力有關酶類的活性的改變。Schuytema等[4]研究則認為氨氮脅迫也會影響動物的生長和免疫功能。

刺參(Apostichopus japonicus), 也稱仿刺參, 屬于棘皮動物門(Echinodermata), 具有極高的營養和藥用價值, 是我國北方海水養殖的重要經濟種類,為沿海地區創造了十分可觀的社會效益和經濟效益[5]。但由于近年來刺參養殖的過速發展和養殖環境的惡化, 導致了刺參病害問題的日趨嚴重, 因此, 進行環境污染對刺參免疫酶活性的研究, 有利于深層次了解其抵抗不良環境的能力。

目前還未見到國內外有關氨氮脅迫對養殖刺參免疫功能影響的研究報道, 基于此, 本試驗在實驗室條件下通過觀測刺參在不同濃度的氨氮連續作用下的若干非特異性免疫指標的變化,初步探討了養殖環境中氨氮污染對刺參免疫力的影響, 以期為刺參養殖的環境生理和免疫機制以及養殖水環境調控提供基礎數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗刺參購自青島李村海產品批發市場, 為當天捕撈大小基本一致的成體活刺參, 平均體質量為62g±1g, 平均體長為 15cm±0.5cm。試驗用氯化銨為國產分析純。

1.2 試驗方法

挑選完好無損、健康活躍、規格基本一致的刺參用于試驗, 刺參在試驗室用自然沉降過濾海水暫養 3 d, 暫養期間持續充氧, 每天投餌 1次, 不完全換水1次, 及時清除水體中的排泄物及剩余餌料, 自然水溫保持在19～21℃, pH 7.9～8.2, 鹽度29～31。

試驗設計分對照組和試驗組A組和B組, 以自然海水(NH4+-N低于0.05 mg/L)作為對照組, 設計3個重復。試驗A組養殖水體添加NH4C1溶液, 未感染細菌, 根據預試驗, 銨態氮的濃度梯度為1.0、2.0、3.0、4.0、6.0mg/L(以水體中的氨氮終濃度表示), 每個梯度設置3個重復, 試驗水體為10L, 每個重復刺參6只, 所有組的鹽度、水溫、餌料等養殖條件與暫養相同, 充氣量也保持一致。試驗期間, 每天定時用奈氏試劑法測定氨氮的濃度, 及時調整養殖水體中的氨氮濃度, 試驗條件同暫養期條件。預試驗結果表明, 在第6天時, 氨氮濃度為6.0 mg/L試驗組的刺參開始出現發病現象, 因此, 本試驗以 5d作為氨氮脅迫的持續時間(各試驗組均未出現死亡現象)。分別在處理1、3、5d后用無菌注射器抽取刺參體腔液, 其中每頭刺參收集體腔液 0.2 mL, 將分別收集的各濃度梯度的每個重復組的刺參體腔液混合后立即放入-80℃冰箱中備用, 待全部取完樣后立即測定各酶活性。試驗B組為感染細菌組, 濃度梯度設置同試驗A組, 于每個整理箱中加入本實驗室分離的刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹病害的病原菌假交替單胞菌Pseudoalteromonas sp., 使水體中Pseudoalteromonas sp.終濃度為 3.5×108個/mL[6]。試驗條件同暫養期間條件, 分別于處理后1、2、4 d取刺參體腔液, 同試驗A組。

超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定參考常雅寧[7]的連苯三酚自氧化法, 按照以下公式計算SOD活力：酶活力(U/mL)=[(1-樣品氧化速率/自氧化速率)/0.5]×4.5×100; 谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性的測定參考鄧修惠等[8]的改良 DTNB比色法, 以每升體液37℃每分鐘催化1μmol GSH氧化的酶量為一個酶活性單位, 計算公式為 GSH-Px(U/L)=(A對照－A測定)/A對照×0.4×1000÷5/0.4=(A對照－A測定)/A對照×200; 堿性磷酸酶(ALP)活性的測定參考磷酸苯二鈉為底物的金氏法[9], 磷酸酶活性定義為100 mL體液在37℃與底物作用30min產生1mg酚為1個金氏單位, 酶活性(金氏單位)=測定管吸光值/標準管吸光值×酚含量×稀釋倍數; 溶菌酶(LSZ)活性的測定參考 Hultmark等[10]的溶壁微球菌粉法, 溶菌活力 UL按(A0－A)/A式計算。

在氨氮脅迫后第6天和第10天, 根據每個處理的病參數目占試驗用參的比例計算累計死亡率。

1.3 實驗數據分析

實驗所得數據以平均數±標準差(M±SD)表示, 運用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析統計。

2 結果與分析

2.1 對刺參超氧化物歧化酶活性的影響

由圖1可知, 在未病菌感染的處理中, 在處理后1 d, 隨著氨氮濃度的增加, 刺參體腔液SOD活性增加, 但隨著處理時間的延長, SOD活性則隨著氨氮處理濃度的增加呈現先增加后降低的趨勢, 處理后第3天不同濃度的氨氮處理刺參體腔液SOD活性分別比對照組高26.7%、63.4%、58.5%、51.8%和26.7%, 差異顯著(P＜0.05); 而處理后第5天不同濃度的氨氮處理刺參體腔液的SOD活性分別為對照組的130.2%、139.2%、135.3%、115.5%和84.0%, 1、2和3 mg/L氨氮處理組 SOD 活性與對照組相比差異顯著(P＜0.05)。在有病菌感染的處理中, 刺參體腔液中SOD 活性均隨氨氮處理的增加呈現先增加后降低的趨勢, 隨著處理時間的延長, SOD 活性也有所下降, 處理后第 3天不同濃度的氨氮處理刺參體腔液的 SOD活性分別為對照組的 117.6%、156.0%、143.9%、111.9%和 79.9%; 處理后第 5天不同濃度的氨氮處理刺參體腔液的SOD活性分別為對照組的122.8%、162.1%、143.0%、104.5%和 78.7%。說明高濃度氨氮處理抑制SOD活性, 而適當病菌感染可誘導SOD活性。

圖1 不同濃度的氨氮處理對刺參體腔液超氧化物歧化酶活性的影響Fig. 1 Effect of ammmonia-N concentrations on superoxide dismutase activity in the coelomic fluid of sea cucumbers

2.2 對刺參谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響

由圖2可知, 在未病菌感染的處理中, 隨著處理時間的延長, 體腔液 GPx活性表現為逐漸升高的趨勢, 但高濃度氨氮處理則導致 GPx活性下降, 處理后第 5天, 不同濃度的氨氮處理刺參體腔液的 GPx活性分別為對照組的 212.7%、266.3%、202.4%、133.3%和 79.1%, 差異顯著(P＜0.05); 在病菌感染的處理中, 隨著處理時間的延長, GPx活性也表現為逐漸升高的趨勢, 處理后第5天, 不同濃度的氨氮處理刺參體腔液的 GPx活性分別為對照組的 170.4%、189.9%、178%、148.7%和 77.4%, 差異顯著(P＜0．05)。說明在較低濃度氨氮處理時, 可促進刺參的 GPx活性, 而病原菌感染則抑制了氨氮脅迫對 GPx活性的誘導作用。

圖2 不同濃度的氨氮處理對刺參體腔液谷胱甘肽過氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of ammmonia-N concentrations on glutathione peroxidase activity in the coelomic fluid of sea cucumbers

2.3 對刺參溶菌酶活性的影響

圖3 不同濃度的氨氮處理對刺參體腔液溶菌酶活性的影響Fig. 3 Effect of ammmonia-N concentrations on lysozyme activity in the coelomic fluid of sea cucumbers

由圖 3可知, 處理初期, 在未病菌感染的處理中, 體腔液中 LSZ的活性呈現逐漸升高的趨勢, 但隨著處理時間的延長和氨氮處理濃度的增加, 體腔液LSZ活性表現為先上升后下降的趨勢, 處理后第5天, 不同濃度的氨氮處理刺參體腔液的 LSZ活性分別為對照組的 102.9%、109.6%、115.5%、77.0%和66.5%, 4 mg/L和63 mg/L氨氮處理組SOD 活性與對照組相比差異顯著(P＜0.05); 在病菌感染的處理中,隨著處理時間的延長和氨氮處理濃度的增加, 刺參體腔液 LSZ活性呈現先增加后降低的趨勢, 處理后第 5天, 活性分別為對照組的 110.7%、121.5%、107.9%、90.4%和70.7%。說明高濃度氨氮處理強度可降低 LSZ活性, 而適宜濃度氮處理可提高病菌感染情況下的LSZ活性。

2.4 對刺參堿性磷酸酶活性的影響

由圖4可知, 在未病菌感染的處理中, 隨著處理時間的延長和氨氮處理濃度的增加, 體腔液 ALP活性先增加后降低, 較高濃度氨氮處理導致ALP 活性的降低; 在病菌感染的處理中, 隨著處理時間的延長和氨氮處理濃度的增加, ALP活性先上升后下降的趨勢更加明顯, 處理后第5天, 不同濃度氨氮處理的刺參體腔液的ALP 活性分別為對照組的104.3%、138.8%、119.1%、76.3%和70.9%。說明高濃度氨氮脅迫處理降低了 ALP活性, 而適宜濃度的氮處理可促進病菌感染誘導的ALP活性。

2.5 對刺參發病情況的影響

在有病原菌感染的情況下, 隨著處理氨氮處理濃度升高和處理時間的延長, 發病刺參的癥狀表現為排臟, 觸手伸縮活力下降, 腹部管足出現潰瘍狀病斑, 然后圍口處潰爛, 最終導致刺參死亡。由圖 5可知, 在處理后第6天, 隨著處理強度的增加, 刺參的累計發病死亡率明顯上升, 3、4和6 mg/L的氨氮脅迫下刺參死亡率比對照組增加了11.1%、22.3%和40.9% , 4和6 mg/L的氨氮脅迫下刺參死亡率與對照組差異顯著(P＜0.05), 在處理后第12天, 4和6 mg/L的氨氮脅迫下刺參死亡率均比對照組增加了 22.2%,差異顯著(P＜0.05); 在沒有病菌感染的情況下, 只有4和6 mg/L濃度的氨氮處理組的刺參發病死亡, 死亡率為 11.1%和 33.3%; 而在病原菌感染的情況下,刺參從較低濃度氨氮處理組就開始出現發病癥狀, 并且隨著氮源濃度升高發病死亡率增加。

圖4 不同濃度的氨氮處理對刺參體腔液堿性磷酸酶活性的影響Fig. 4 Effect of ammmonia-N concentrations on alkaline phosphatase activity in the coelomic fluid of sea cucumbers

圖5 不同濃度的氨氮處理對刺參發病情況的影響Fig. 5 Effect of ammmonia-N concentrations on the infection incidence of sea cucumbers

3 討論

刺參同其他棘皮動物一樣, 進化地位較低, 不具備專門的免疫組織、器官和特異性免疫系統, 主要依賴由細胞免疫和體液免疫組成的非特異性免疫系統來預防疾病。體液性免疫因子對無脊椎動物機體的免疫防御反應具有極為重要的作用, 體液性免疫因子包括天然形成的或誘導產生的各種生物活性分子, 以及各種免疫活性的酶類。超氧化物歧化酶是生物體內抗氧化防御性功能的酶, 是活性氧自由基的天然消除劑。研究證明, 周圍環境的污染物質量濃度升高可導致機體內活性氧的增加[11-12], 而超氧化物歧化酶可消除體內多余的自由基, 使自由基的形成與消除處于動態平衡之中, 進而免除對生物體的傷害, 因此, 超氧化物歧化酶與生物體的免疫水平密切相關, 對增強吞噬細胞的防御能力和機體的免疫功能具有重要作用[13]。本試驗中, 2、3和4 mg/L濃度的氨氮處理組的SOD活性最高, 而同時病原菌感染的情況下, SOD活性被進一步誘導, 并且隨著感染時間的延長, SOD活性增加的趨勢愈加明顯(圖1)但較高濃度的氨氮處理下, SOD活性增加趨勢減弱, 這表明適宜濃度的氮可以減輕活性氧對刺參造成的機體損傷, 也能促進刺參的免疫水平, 從而提高對病原的免疫防御能力。谷胱甘肽過氧化物酶能保護生物膜和生物大分子結構免受氧化損傷, 而且可以清除由活性氧和·OH誘發的脂質過氧化物, 保護細胞膜結構和功能的完整性, 還具有抑制細菌的作用[14]。本試驗中, 水體中的氮處理誘導 GPx活性, 其中 2和3 mg/L濃度氮處理組促進GPx活性的作用最強,在高濃度氮處理同時感染病原菌的情況下, GPx活性明顯受到抑制, 而病原菌卻增強了較低濃度氨氮處理下的GPx活性(圖2), 這表明氮處理可以減輕活性氧對刺參造成的細胞膜損傷, 而只有適宜濃度的氨氮才能促進刺參體腔液的抑菌作用。

刺參由于缺乏特異性免疫反應, 機體只能依靠各種非特異性免疫細胞或體液免疫因子來清除異物,在多種體液因子中, 溶菌酶、磷酸酶等常被用做衡量免疫活力高低的參照指標。表現溶菌活性的因子主要是溶菌酶[15], 溶菌酶是由單核細胞、巨噬細胞和嗜中性細胞產生的能溶解細胞壁、具有抗氧化作用的酶, 在非特異性免疫中起著重要作用, 有文獻推測脅迫強度可能對溶菌酶活性的變化有影響[16]。血清中的溶菌酶(LSZ)主要由吞噬細胞釋放, 故可作為吞噬系統功能的指標。本試驗中, 較低濃度的氨氮處理可促進溶菌酶活性的升高, 而同時病原菌感染的情況下, 溶菌酶活性增加明顯, 但 3mg/L以上濃度會較快地降低溶菌酶活力, 且隨著時間的延長, 其活力降低的幅度越明顯(圖 3), 表明在氨氮脅迫初期,刺參受到較強應激, 溶菌酶活力因此而升高, 而此后刺參機體則產生了一定的耐受性, 溶菌酶活力趨于降低, 該結果也表明刺參在高濃度氨氮環境或長期處于較低氨氮環境下, 均會降低其血清溶菌酶活力, 溶菌酶活力的下降可能是導致吞噬細胞吞噬活性降低的重要因素之一。

ALP是溶酶體的標志酶之一, 可通過改變細菌表面結構而增強其異己性, 起調理素的作用, 從而加速吞噬細胞的吞噬和異物的降解速度[17]。本試驗中, 水體低濃度的氨氮脅迫明顯可誘導 ALP活性的產生, 同時病原菌感染的情況下, ALP增加趨勢更加明顯, 但在氨氮濃度為4 mg/L和6 mg/L的脅迫下,ALP活性則降低(圖4), 說明當氨氮濃度大于3 mg/L時, 超過了刺參機體的調節范圍。因此適宜濃度的氨氮可增強刺參體腔液對病原的殺滅作用以減輕組織受損。刺參體腔液免疫酶的變化表明, 較低濃度的氨氮脅迫處理對刺參免疫性刺激最強, 然而在菌感染的情況下刺參發病癥狀在脅迫解除后可恢復, 較高濃度氨氮處理的情況在脅迫解除后很難恢復(圖 5),這表明刺參組織損傷相對于體腔液酶活變化有一定的滯后性, 適宜濃度氮處理刺激的免疫性增強需要一定時間才表現出抗病性。

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Effect of exposure to ammonia nitrogen stress on immune enzyme of holothurianApostichopus japonicus

LIU Hong-zhan1, ZHENG Feng-rong2, SUN Xiu-qin2, TANG Xue-xi3,DONG Shuang-lin3
(1．Marine College of Shandong University at Weihai, Weihai 264209, China; 2. First Institute of Oceanography SOA, Qingdao 266061, China; 3. College of Marine Life Sciences of Ocean University of China, Qingdao 266003,China)

Nov.,27,2011

ammonia nitrogen stress; holothurian; enzyme of coelomic fluid; immune response

The change of immune enzyme in the coelomic fluid of holothurianApostichopus japonicusunder ammonia treatment and pathogen-infected condition was investigated. The results indicated that with the increase of ammonia-N concentration, the activities of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx), alkaline phosphatase (ALP) and lysozyme (LYZ) were first increased and then decreased. In the presence of bacteria infection, lower concentrations of ammonia nitrogen could increase the activities of SOD, GPX, ALP and LSZ, but higher concentrations of ammonia nitrogen treatment inhibited the enzyme activities. This suggested that moderate aquatic ammonia nitrogen stresses may enhance the immunity of sea cucumber, reduce the immune damage caused by bacteria infection, and promote the disease resistance ability of sea cucumber. The cumulative mortality of sea cucumber were 44.4%, 55.6% and 72.2% in the presence of pathogen (Pseudoalteromonassp.) infection and 3, 4 and 6 mg/L ammonia nitrogen treatment, which were higher than that of control group, suggesting that higher concentrations of ammonia nitrogen stress can significantly reduce the immunity of the sea cucumber, increase susceptibility to pathogens. Therefore, regulation and control of ammonia nitrogen concentration are very important during sea cucumber cultivation.

S91

A

1000-3096(2012)08-0047-06

2011-11-27;

2012-02-22

海洋公益專項(200905020); 國家海洋局海洋生物活性物質與現代分析技術重點實驗室開放基金項目(MBSMAT-2011-06)

劉洪展(1975-), 男, 講師, 山東濰坊人, 從事細胞毒理學研究, E-mail： hongzhan2002@163.com; 鄭風榮, 通信作者, 副研究員, 從事海洋生物病害與免疫學研究, 電話： 15192602616, E-mail：zhengfr@fio.org.cn; 孫修勤, 通信作者, 研究員, 從事海洋生物學研究,電話： 13608964893, E-mail： xiuqin_sun@fio.org.cn

梁德海)