膠原誘導型大鼠類風濕關節炎模型的制備*

陳彩娥 崔向軍 鄭 可 王 琴

(三峽大學第一臨床醫學院風濕免疫科，湖北 宜昌 443000)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，主要臨床表現為關節的慢性炎癥。其病理為慢性滑膜炎，侵及下層的軟骨，造成骨關節破壞。該病好發于手、腕、足等小關節，反復發作，呈對稱分布。早期關節紅、腫、熱、痛和功能障礙，繼而導致軟骨破壞，關節間隙變窄，晚期關節可出現不同程度的僵硬畸形，并伴有骨和骨骼肌的萎縮，極易致殘[1]。其發病機制至今尚未明確，一般認為其發病與遺傳、感染、自身免疫及環境因素有關。骨關節的損害導致疼痛和功能障礙，嚴重影響生活質量。由于其遺傳多樣性和臨床特點的異質性，為類風濕關節炎的科學研究帶來了很大的困難。為了更好的探索類風濕關節炎的機制，建立一種有效的動物模型是研究類風濕關節炎的發病機制、治療及預防必要的手段。本文通過改良CIA 模型的制備為治療類風濕關節炎提供更可靠的動物模型。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

武漢大學實驗動物中心購買的40只SD健康雄性大鼠，體重80～100 g，飼養于三峽大學實驗動物中心，普通飼養環境，每日給予普通飼料，自由水置于籠側，可自由飲用，適應性喂養兩周。將40只大鼠隨機分為兩組，35只一組為實驗組，5只一組為對照組。

1.2 方法

1.2.1試劑的配置

將Ⅱ型膠原溶液滴加至冰冷的等體積完全弗氏佐劑中，在冰浴狀態下，用微型旋渦混勻器充分乳化制成Ⅱ型膠原乳劑，此過程一定要注意低溫操作。將乳化好的混合物滴一滴至水中，若乳化成功，乳化物則形成一個乳滴，浮在水面，若不成功，乳化物則很快擴散開來。

1.2.2動物的免疫

造模方法根據參考文獻[2]和預實驗方法進行改良。采用足跖部皮下注射法，將充分乳化制成的Ⅱ型膠原乳劑注射到大鼠的足跖部皮下，首次免疫一側一次注入Ⅱ型膠原乳劑0.2 ml， 7天后用同樣方法加強免疫，一側一次注入Ⅱ型膠原乳劑0.1 ml。

1.2.3觀察大鼠一般情況并進行關節指數評分

觀察正常大鼠與模型組大鼠進食、飲水情況以及皮膚、關節變化情況。根據關節腫脹指數評分系統進行，評分標準如下：0分—無紅腫，1分—小趾關節紅腫，2分—趾關節和足跖腫脹，3分—踝關節以下的足爪腫脹，4分—包括踝關節以內的全部足爪腫脹。

1.2.4組織病理學檢測

取滑膜組織修剪整齊，乙醇常規脫水，石蠟包埋，在切片機下常規組織學切片(厚5 μm)，行HE染色，觀察滑膜組織病理形態學的變化情況。

統計學方法 采用SPSS1110統計軟件。數據比較用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況觀察及關節評分

正常對照組大鼠，活動自如，飲食、飲水正常，毛色有光澤，體重逐漸增加；造模組于初次免疫第5天左右，注射部位針眼處出現小潰瘍，給予加強免疫后第三天，與正常對照組相比，大鼠進食、飲水量減少，毛發干枯易脫落，光澤感減低，并且大鼠之間的攻擊性增強；于初次免疫后第10天左右出現關節紅腫，第20天左右28只大鼠關節表面皮膚充血，呈粉紅色發亮狀態，皮溫升高，關節腫脹，活動受限。關節炎成對稱性分布，以后肢最為明顯；造模第21天對大鼠的關節炎表現進行觀察評分。根據關節腫脹指數評分系統，造模組共35只大鼠，其中評分3分以上大鼠28只，成功率造模成功率為80%。正常對照組足爪關節無紅腫；造模組大鼠足跖部出現腫脹，關節明顯紅腫增粗，活動受限。造模組與正常組關節炎評分比較，P<0.05，兩組有顯著差異(見表1)。

表1 正常對照組與造模組的關節炎評分結果

注：與正常組相比，☆P<0.05

2.2 組織病理學檢查

HE染色，正常對照組，滑膜由1～2層滑膜細胞組成，無增生，細胞排列整齊，滑膜組織中無炎性細胞浸潤(圖1，圖2)；造模組，滑膜細胞水腫，有3～5層明顯增生，細胞排列不整齊，滑膜組織中有大量的炎性細胞浸潤(圖3,圖4)。

圖1 (×100)

圖2 (×100)

圖3 (×100)

圖4(×400)

3 討 論

隨著動物模型的廣泛應用，為更好的研究類風濕關節炎提供了強有力的工具。迄今為止，可供研究RA的動物模型有很多種，例如，病證結合的動物模型，包括腎虛痹、證模型、風寒濕痹證模型、風濕熱痹證模型；單純疾病模型，包括佐劑性關節炎(AA)模型、膠原誘導性關節炎(CIA)模型、卵蛋白誘導性動物模型、樸日斯烷誘導的關節炎(PIA)模型、油誘導的關節炎(OIA)模型等。其中，由于膠原誘導性關節炎模型的發生發展與人類的類風濕關節炎有很

多相似之處，為深入認識RA的發病機制提供了重要工具，是目前國際公認的能代表研究RA發病機制的理想實驗性動物模型[3]。

CIA模型是Trentham等[4]于1977首次創立的實驗性關節炎動物模型。Trenthem發現約50%的RA患者，血清和關節滑液中存在著抗膠原的自身抗體，這表明，膠原可能誘導體內產生關節炎性質的自身免疫反應，根據這一理論，用牛Ⅱ型膠原(CⅡ)免疫大鼠，從而成功地創立了ClA模型。本實驗結合文獻及預試驗對CIA造模進行改良，將免疫方法改為足跖部皮下注射法并適量調整使用劑量，在實驗過程中我們發現，在臨床表現、組織病理各方面都與人類的類風濕關節炎相似。證明該動物模型能成為進一步研究RA的發病機理及藥物治療RA的機制奠定基礎。

[1] 王蘭英. 類風濕關節炎實驗室檢查的進展[J]. 中國社區醫師(醫學專業),2010,12(34):169.

[2] 韓曉楓，馬寶驪，張繼英，等.膠原誘導關節炎大鼠淋巴細胞的過繼轉移[J].免疫學雜志，2002,18(1):10.

[3] Feng H ， Yamaki K ， Takano H ， et al．Suppression of Thland Th 2immune responsesin mice by sinomenine analkaloid extracted from the Chinese medicinalplantSinomenium acutum [J].Planta Medica,2006,72 ( 15 ): 1383-1388．

[4] Trentham DE ， Townes AS ， Kang AH. Autoimmunity to type II collagen ： an experimental model ofarthritis[J]. J Exp Med ， 1977 ， 146 ： 857-868.