霉酚酸酯對糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用及其對MIF、MCP-1表達(dá)影響的研究*

呂學(xué)愛 胡迎春

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院泌尿內(nèi)一科，山東 泰安 271000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN) 是糖尿病最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥，隨著我國糖尿病發(fā)病率的逐年提高，DN 已成為導(dǎo)致尿毒癥腎透析的主要病因之一。目前DN確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，除了糖脂代謝紊亂和血流動(dòng)力學(xué)異常，許多實(shí)驗(yàn)和臨床資料[1-2]均提示糖尿病腎病往往存在炎細(xì)胞浸潤和炎癥介質(zhì)升高，但其具體作用機(jī)制還不十分明確，本研究通過對單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP1)、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)在糖尿病大鼠腎組織表達(dá)的研究，探討霉酚酸酯對腎臟的可能保護(hù)機(jī)制，為霉酚酸酯在糖尿病腎病患者中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

鏈脲菌素(STZ)，美國Sigma公司；霉酚酸酯膠囊，上海羅氏制藥有限公司；125I-ALB放射免疫試劉盒，中國原子能科學(xué)研究院同位素研究所；SYBR Green RT PCR Reagents Kit，AmpliTaq GlodDNA Polymerase，美國ABI公司；MCP-1、MIF與GAPDH引物，上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 動(dòng)物模型的建立與分組

雄性Wistar大鼠55只(6～8周齡，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，行右腎切除術(shù)。隨機(jī)分成3組：陰性對照組(A組)15只，糖尿病組(B組)20只，霉酚酸酯治療組(C組)20只。B組和C組40只大鼠，STZ以60 mg/kg的劑量行腹腔注射。72 h后，靜脈血測血糖，濃度大于16.7 mmol/L即為糖尿病建模成功；A組15只大鼠注射等量緩沖液。C組建模成功后給予霉酚酸酯15 mg·kg-1·d-1灌胃(250 mg霉酚酸酯膠囊與0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液配制成4 mg/ml的MMF混懸液，4 ℃保存)，A組和B組給相同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。三組大鼠，胰島素用量據(jù)血糖情況調(diào)整，觀察周期均為16周。

1.3 標(biāo)本處理

1.3.1尿標(biāo)本

收集大鼠24 h尿液，記錄尿量，-20℃保存。

1.3.2腎臟標(biāo)本

處死大鼠，取腎，迅速剝離腎包膜，稱重后置于4 ℃生理鹽水中；經(jīng)腎門將腎臟縱向剖開，分離腎皮質(zhì)，切成小塊；腎組織一部分放入福爾馬林液中固定，石蠟包埋，切片，以備行HE、PAS染色；小塊腎組織戊二醛固定，待用電鏡檢查；另將腎組織液氮保存，以備RT-PCR檢測。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1生化指標(biāo)檢測 24 h 尿白蛋白測定采用放射免疫分析法。

1.4.2腎組織形態(tài)學(xué)分析

常規(guī)HE、PAS染色，光鏡下(×600)每張PAS染色切片隨機(jī)取50個(gè)腎小球，HPIAS-1000生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測定腎小球平均截面積(Mean Glomerular Area， MGA)、系膜平均面積(Mean Mesangial Area， MMA)，并根據(jù)公式[3]：腎小球平均體積(Mean Glomerular Volume， MGV)=1.25·(MGA)3/2、系膜面積比(Fractional Mesangial Area， FMA)=MMA/MGA計(jì)算得到MGV和FMA。

1.4.3腎組織總 RNA 提取及RT-PCR

腎皮質(zhì)組織總RNA提取按 Trizol 說明書進(jìn)行。2 μg總 RNA 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，以此為模板用MCP-1、MIF引物經(jīng) PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增。MCP-1引物序列為：上游5’ _ ACC TGC TGC TAC TCA TTC ACT_3’，下游5’ _ CAT CTT GCA TTT AAG GAT TTC _3’， 退火溫度為 58 ℃ ，產(chǎn)物為 454 bp；MIF引物序列為: 上游5’ _CCA TGC CTA TGT TCA TCG TG _3’，下 游5’ _GAA CAG CGG TCA GTA AGT GC _3’，退火溫度為 54 ℃ ，產(chǎn)物為350 bp； GAPDH引物序列為: 上游5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’，下游5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’，退火溫度為 55 ℃ ，產(chǎn)物為 450 bp。

以空白管不出現(xiàn)陽性為準(zhǔn)，調(diào)整基線。以與基線交點(diǎn)的循環(huán)次數(shù)(Ct值)為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)管稀釋濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用待測樣本的Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出相應(yīng)的基因拷貝數(shù)。結(jié)果以待測基因的拷貝數(shù)與內(nèi)參拷貝數(shù)的比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 一般觀察

A組大鼠生長發(fā)育良好；B、C二組大鼠，血糖升高明顯并出現(xiàn)多尿多飲多食、體重增長緩慢、毛色晦暗、精神萎靡等糖尿病癥狀，其中10只因感染死亡，未納入最后統(tǒng)計(jì)。最終完成實(shí)驗(yàn)的大鼠，分別為A組15只， B組14只， C組16只。

2.2尿白蛋白排泄率(UAER)

B組大鼠UAER與A組相比，于第8周時(shí)即顯著升高(14.00倍)，第16周時(shí)，UAER仍持續(xù)上升(25.86倍)，比第8周時(shí)升高95%。C組與B組相比，UAER均有不同程度的下降(P<0.05)，但仍高于A組(P<0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠尿蛋白排泄率的比較

▲P<0.01 group B vs group A；*P<0.05 group C vs group B

2.3 腎臟組織形態(tài)學(xué)改變

2.3.1大體形態(tài)(見圖1～3)。

第16周時(shí)，光鏡下，B組大鼠腎小球體積增大，基底膜增厚，系膜擴(kuò)張，紅染區(qū)明顯擴(kuò)大，腎小球毛細(xì)血管腔受壓變窄。C組大鼠的上述病變有不同程度的減輕。電鏡下，正常對照組腎小球基底膜及足突完整且無明顯增厚，B組大鼠可見系膜區(qū)基質(zhì)明顯增多，足突部分融合，系膜細(xì)胞增生，基底膜不規(guī)則增厚伴斷裂，C組大鼠病變均較B組減輕。

圖1 糖尿病大鼠腎臟大體形態(tài)—HE染色(× 600)

圖2 糖尿病大鼠腎臟大體形態(tài)—PAS染色(× 600)

圖3 糖尿病大鼠腎臟大體形態(tài)—電鏡(×10000)

2.3.1腎小球平均體積(MGV)和系膜面積比(FMA)的比較(見表2)。

16周時(shí)，B組大鼠MGV和FMA比A組明顯升高(分別為62%、179%)。C組MGV和FMA比B組有不同程度的下降(P<0.05)；但仍高于A組(P<0.05)。

表2 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)變化的比較

▲P<0.01 group B vs group A；*P<0.05 group C vs group B

2.4 腎臟MCP-1、MIF基因表達(dá)情況

和A組相比，B組大鼠腎臟MCP-1、MIF的mRNA表達(dá)明顯升高，分別為33.91倍和194.2倍；和B組相比，C組大鼠腎臟MCP-1、MIF的mRNA表達(dá)均有所下調(diào)(P<0.05)，但仍高于A組(見表3)。

表3 各組大鼠腎臟MCP-1、MIF mRNA表達(dá)比較

▲P<0.01 group B vs group A；**P<0.05 group C vs group B；*P<0.01 group C vs group B

2.5 相關(guān)性分析

2.5.1MCP-1、MIFmRNA表達(dá)與蛋白尿的關(guān)系

腎臟MCP-1、MIFmRNA表達(dá)水平與UAER成正相關(guān)(r=0.758，P<0.05；r=0.657，P<0.05)。提示糖尿病大鼠腎臟MCP-1、MIFmRNA表達(dá)水平升高與尿白蛋白排出呈正相關(guān)。

2.5.2MCP-1、MIFmRNA表達(dá)與腎臟組織形態(tài)學(xué)改變的關(guān)系(見表4)

腎臟MCP-1、MIFmRNA表達(dá)水平與MGV和FMA成正相關(guān)，提示糖尿病狀態(tài)下，腎臟MCP-1、MIF表達(dá)增高與腎臟形態(tài)學(xué)損傷呈正相關(guān)。

表4 MCP-1、MIF mRNA表達(dá)水平與MGV、FMA之間的相關(guān)系數(shù)(r值)

MCP-1MIFMGV0.682*0.593*FMA0.789*0.876*

*P<0.05

3 討 論

糖尿病是一種慢性低水平的炎性疾病，腎組織單核巨噬細(xì)胞浸潤是DN的重要病理特征[4]，其作用機(jī)制涉及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚等諸多因素。霉酚酸酯(MMF)是一種新型免疫抑制劑，廣泛應(yīng)用于移植病人的抗排斥反應(yīng)，其代謝產(chǎn)物霉酚酸通過抑制次黃嘌呤單核昔酸脫氫酶而抑制T、B淋巴細(xì)胞的浸潤和增殖，它能直接抑制巨噬細(xì)胞和活化的系膜細(xì)胞增殖[5]，抑制黏附分子的表達(dá)[6]，從而起到抗炎作用。

MMF治療糖尿病目前仍處于動(dòng)物試驗(yàn)階段。Wu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病的早期，MMF可能通過上調(diào)nephrin和podocin的表達(dá)明顯減少STZ大鼠24h尿蛋白排泄率。有研究表明[8]，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎小球早期就有MCP-1 的表達(dá)增加，并與腎小球結(jié)構(gòu)變化、腎小球硬化密切相關(guān)。MMF對腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制是：通過下調(diào)PCNA[9]的表達(dá)，下調(diào)MCP-1與ICAM-1的表達(dá)，從而抑制單核巨噬細(xì)胞增殖，后者進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，造成血管通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白漏出，漏出的蛋白又進(jìn)一步刺激ECM聚集，促進(jìn)腎小球的硬化。我們的試驗(yàn)結(jié)果表明，和對照組相比，糖尿病大鼠組MCP-1 mRNA表達(dá)明顯增加，霉酚酸酯治療組則顯著下調(diào)，而且MCP-1 mRNA的表達(dá)與腎臟損害指標(biāo)24h尿白蛋白排泄率、MGV、FMA等成正相關(guān)。

巨噬細(xì)胞是腎組織的主要浸潤細(xì)胞，且與蛋白尿程度及腎功能衰退密切相關(guān)[10]。MIF為活化T淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種可溶性細(xì)胞因子，對巨噬細(xì)胞的粘附、擴(kuò)散遷移、吞噬起促進(jìn)作用。有研究認(rèn)為[11]，MIF是感染、自身免疫性疾病、膿毒癥、2型DM、腫瘤、肥胖等系統(tǒng)性炎癥疾病的生物學(xué)標(biāo)志，在糖耐量異常及2型DM患者體內(nèi)表達(dá)明顯升高，是糖尿病發(fā)生的高危因素[12]。Bruchfeld A[13]等研究發(fā)現(xiàn)，MIF在慢性腎臟病中高表達(dá)，其在腎臟損傷中的作用與[14]足細(xì)胞損傷有關(guān)。國內(nèi)外對MIF在糖尿病腎病中表達(dá)的報(bào)道較少，我們研究發(fā)現(xiàn)MIF在正常腎組織中幾乎不表達(dá)，在糖尿病大鼠腎組織中高表達(dá)，且與白蛋白尿、腎小球硬化程度具有相關(guān)性，為糖尿病腎病炎癥相關(guān)的直接證據(jù)，這與Kipari的研究[15]一致。我們的結(jié)果表明，MMF可下調(diào)糖尿病大鼠腎臟MCP1、MIF mRNA的表達(dá)，減少單核-巨噬細(xì)胞聚集、降低尿蛋白、抑制腎臟肥大、降低ECM沉積，防止腎臟的纖維化，抑制DN的發(fā)生發(fā)展。

總之，無論糖尿病腎病的始動(dòng)因素是什么，炎癥反應(yīng)，包括單核-巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的聚集，是促使腎臟損傷不斷進(jìn)展的必要條件。隨著人們對炎癥在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的新認(rèn)識以及抗炎治療在動(dòng)物模型中取得成功的例子，霉酚酸酯抗炎治療將有望成為治療糖尿病腎病的一種新手段。

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