HIV－P24核酸適配體的篩選

張 寧，毛愛紅，馬 瑾，廖世奇*，張麗瓊，王曉清，馬 君

(1.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050;2.甘肅省醫(yī)學科學研究院，甘肅蘭州730050)

HIV－P24核酸適配體的篩選

張 寧1，毛愛紅2，馬 瑾2，廖世奇2*，張麗瓊1，王曉清2，馬 君1

(1.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050;2.甘肅省醫(yī)學科學研究院，甘肅蘭州730050)

目的 利用SELEX技術篩選HIV-P24的核酸適配體，為艾滋病的診斷和治療奠定基礎。方法 以重組P24為篩選靶，用SELEX技術從隨機寡核苷酸庫中篩選與HIV-P24結合的寡核苷酸，利用凝膠阻滯實驗鑒定第12輪篩選到的寡核苷酸與HIV-P24的結合，再用Dot-blot法篩選出與HIV-P24結合的核酸適配體，并檢測核酸適配體識別HIV-P24的特異性。結果 Dot-blot篩選到5條與HIV-P24有較強結合能力的核酸適配體，且均為不同的序列。特異性檢測顯示，18和26號配體只與HIV-P24特異性結合，而與人血清白蛋白、牛血清白蛋白和脫脂奶粉均無明顯結合。結論 成功篩選到2條特異結合HIV-P24的核酸適配體，為其應用于艾滋病診斷和治療提供了實驗基礎。

SELEX技術;HIV-P24;核酸適配體

P24是HIV-1的核心抗原，在病毒的包裝和成熟過程起重要作用。機體感染HIV-1后，P24在血清中出現(xiàn)的時間較早，一般在HIV-1感染后2～3周就可以檢測，可作為艾滋病窗口期檢測的血清標志物。通過檢測血液中的P24，可達到早期診斷和治療的目的［1－2］。

核酸適配體是通過SELEX技術篩選得到的一類寡核苷酸分子，能與靶分子強特異、高親和力地結合，并發(fā)揮生物學效應［3－4］。由于其篩選靶分子范圍廣、分子質量小、免疫原性低，且可進行化學合成、改造與標記［5］，核酸適配體越來越受到人們的青睞。目前，在化學分析與檢測、臨床診斷與治療及藥學等領域已對其開展廣泛的應用基礎研究［6－9］。

本研究利用SELEX技術篩選HIV-P24特異性核酸適配體，為建立核酸適配體輔助的P24檢測方法奠定基礎，對艾滋病的診斷和治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

HIV-P24重組蛋白(2 g/L)(北京科衛(wèi)臨床診斷試劑有限公司);隨機寡核苷酸庫(2.5 nmoles，84 bp)5'-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC40(N)CT GCAGGTCGACGCATGCGCCG-3'(N=A，T，C，G)、引物 P9(5'-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-3')、P12(5'-CGGCGCATGCGTCGACCTGCAG-3')和M13-47(5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3')(上海生物工程公司合成);NC膜(膜孔徑0.45 μm)(PALL公司);大腸桿菌JM-109(甘肅省醫(yī)學科學研究院提供);pMD18-T Vector系統(tǒng)(TaKaRa公司);［α-32P］dATP(北京福瑞生物工程公司);PCR所用試劑(上海生物工程公司);其他試劑均為國外或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 HIV-P24特異性寡核苷酸篩選:1)篩選:將5 μL HIV-P24(1 g/L)點至圓形 NC膜(半徑為0.2 cm)中心，待NC膜干燥后，置于0.5 mL的離心管(篩選管)，加入50 μL封閉液(含5%脫脂奶粉、100 g/L鮭魚精 DNA的 PBS溶液)37℃孵育2 h。同時設立不加P24的NC膜為反篩管。用含0.05%Tween-20的PBS溶液分別洗滌篩選管和反篩管3次，每次3 min。用50 μL 10×緩沖液溶解寡核苷酸庫，95℃變性5 min，降至4℃。首先把變性后的庫加入反篩管，37℃孵育1 h。吸出反篩管中的庫，加入篩選管，37℃孵育1 h。篩選管和反篩管分別用含0.05%Tween-20的 PBS溶液洗滌 3次，每次3 min。然后兩管中分別加入200 μL洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，4 mol/L 異 硫 氰 酸 胍，1 mmol/L DTT，pH 8.3)，于80 ℃水浴15 min，立即降到4℃，吸取兩管中的洗脫液，酚氯仿抽提、乙醇沉淀回收DNA，用50 μL超純水溶解待用。2)PCR鑒定回收到的DNA:從上述回收產(chǎn)物中取10 μL為模板，配置100 μL PCR體系:10×擴增緩沖液(不含MgCl2)10 μL，Mg2+(25 mmol/L)5 μL，4 種 dNTP 混合物(每種2.5 mmol/L)8 μL，引物 P9(25 mmol/L)1 μL，引物 P12(25 mmol/L)1 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，模板10 μL，加超純水至100 μL。進行 PCR擴增:94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 30 s，共21個循環(huán)。每3個循環(huán)取樣10 μL，進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對比篩選管和反篩管回收到的DNA的量，確定寡核苷酸對P24的富集情況。把篩選管回收到的ssDNA制備成dsDNA。3)不對稱PCR制備ssDNA:從 dsDNA產(chǎn)物中取10 μL為模板，配置100 μL PCR體系:10×擴增緩沖液(不含 MgCl2)10 μL，Mg2+(25 mmol/L)5 μL，4 種 dNTP 混合物(每 種 2.5 mmol/L)8 μL，引 物 P9(25 mmol/L)2 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，模板10 μL，加超純水至100 μL。進行 PCR 擴增:94℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)。每隔5個循環(huán)取樣10 μL，進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，確定制備ss-DNA的最佳PCR循環(huán)數(shù)，制備ssDNA。ssDNA經(jīng)切膠純化后，作為次級庫，用于下一輪篩選。

1.2.2 凝膠阻滯實驗鑒定P24-ssDNA復合物:最后一輪篩選得到的寡核苷酸用［α-32P］dATP標記，在10 μL 10×緩沖液中與5 μL HIV-P24 37 ℃孵育1 h結合，采用瓊脂糖凝膠電泳(1.5%W/V瓊脂糖，1×TAE緩沖體系，穩(wěn)壓80 V)分離P24-ssDNA復合物，同時設置P24和ssDNA兩個參照。放射自顯影和考馬斯亮藍染色后，觀察P24-ssDNA復合物的阻滯條帶。

1.2.3 寡核苷酸轉化大腸桿菌JM-109:將篩選到的寡核苷酸制備成 dsDNA，并切膠純化。按照pMD18-T Vector試劑盒操作，連接 dsDNA到pMD18-T Vector，轉化大腸桿菌JM-109，菌液涂布在含有氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基上。待長出克隆后，挑取單克隆培養(yǎng)，采用通用引物M13-47和特異性引物P9/P12交錯PCR法鑒定陽性克隆。

1.2.4 Dot-blot篩選與HIV-P24結合的配體:將已鑒定的陽性克隆菌液利用不對稱PCR制備成［α-32P］dATP標記的ssDNA。按方法1.2.1中1)所述，制備結合有P24的NC膜，同時設立空白對照。將32P-ssDNA加到制備好的NC膜上，37℃孵育2 h后，用含0.05%Tween-20的PBS溶液洗膜。NC膜干燥后進行放射自顯影，觀察32P-ssDNA與P24的結合情況。用 Image J軟件對Dot-blot結果進行吸光度分析，將與P24結合程度較好的寡核苷酸測序。

1.2.5 核酸適配體特異性檢測:按方法1.2.1中1)所述，制備分別結合有 HIV-P24(2 μL)、人血清白蛋白(2 μL)、牛血清白蛋白(2 μL)、脫脂奶粉(2 μL)的NC膜。不對稱 PCR制備［α-32P］dATP標記的配體32P-ssDNA，Dot-blot檢測配體32P-ssDNA與各種蛋白的結合情況。

2 結果

2.1 HIV-P24特異性寡核苷酸篩選結果

在篩選過程中，Dot-blot鑒定第 1、4、8、12 輪的次級庫寡核苷酸對P24的富集。Image J軟件分析顯示，反篩管相對參照值(用 PBS為洗滌液的Dot-blot吸光度值)的結合百分比分別為18.9%、16.3%、15.1%和14.3%;篩選管相對參照值的結合百分比分別為21.4%、25.2%、38.4%和51.7%(圖1)，寡核苷酸對HIV-P24逐步得到富集。第12輪篩選時，電泳檢測寡核苷酸對P24的富集效果見圖2。

圖1 寡核苷酸對P24的富集Fig 1 The enrichment of oligonucleotides to P24

2.2 凝膠阻滯實驗

P24-ssDNA復合物在電泳中明顯受到阻滯(圖3)。

2.3 寡核苷酸轉化大腸桿菌結果

鑒定結果顯示，48個菌液均為陽性，目的片段有19個正向插入載體，有29個呈反向插入。

2.4 Dot-blot篩選P24核酸適配體

Image J吸光度值分析顯示，8號、15號、18號、26號和33號菌液制備的32P-ssDNA與P24結合程度較好(表1，圖4)。

圖2 寡核苷酸富集效果Fig 2 The enrichment effect of oligonucleotides

圖3 凝膠阻滯實驗放射自顯影和考馬斯亮蘭染色Fig 3 EMSA assay by radioautography and Coomassie brilliant blue staining

2.5 核酸適配體測序結果

5個結合較強的候選P24核酸適配體測序結果見表2。

2.6 核酸適配體特異性檢測結果

特異性結合實驗顯示，18和26號適配體與HIV-P24有明顯結合(圖5)，而與其他蛋白無顯著結合。

表1 Dot-blot吸光度值分析Table 1 The absorbency analysis of Dot-blot

3 討論

1990年Gold和Ellington等提出核酸適配體技術［10－11］，核酸適配體以其優(yōu)良的特性在醫(yī)學診斷領域的基礎和應用研究備受關注。研究人員利用核酸適配體可通過PCR進行擴增的特點建立了“鄰近連接法”檢測技術［12］，日本學者在2009年報道了immuno-aptamer PCR技術檢測 VEGF［13］。最近，基于核酸適配體的激活式分子探針用于腫瘤活細胞檢測和活體成像的新方法被重點報道［14］。這些檢測方法因其具有高特異性和高靈敏度，為疾病相關標志物分析檢測、病變細胞檢測、腫瘤成像診斷提供了新的思路，具有廣泛的臨床前實驗以及臨床應用前景。

目前，國際醫(yī)學界越來越重視對P24的檢測，把血液中P24的測定作為艾滋病診斷和病情監(jiān)控的一個重要指標，但是臨床上檢測P24的主要方法仍然是ELISA［15］，有關核酸適配體用于P24檢測的研究并未見報道。如果能夠將核酸適配體應用于P24檢測，作為HIV核酸檢測的輔助診斷方式，對艾滋病的確診和病情監(jiān)控將具有一定臨床意義。

圖4 32P-ssDNA與P24的Dot blot結果Fig 4 The result of Dot blot between P24 and different32P-ssDNA

表2 測序得到的核酸適配體序列Table 2 Sequences of the aptamers after sequencing

圖5 適配體32P-ssDNA與不同靶標結合結果Fig 5 Binding result of the aptamer32P-ssDNA with different targets by Dot-blot

本研究以P24為篩選靶，利用經(jīng)典的SELEX技術經(jīng)過12輪篩選，獲得了針對P24富集的寡核苷酸，凝膠阻滯實驗鑒定了寡核苷酸與P24的結合。Dot-blot分析明確了寡核苷酸配體與P24的結合情況，并對配體的特異性進行了檢測，最終獲得了特異性識別和結合P24的核酸適配體。這為核酸適配體用于P24檢測提供了實驗基礎，為P24的檢測提供一種新思路。

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Screening of aptamers to HIV-P24

ZHANG Ning1，MAO Ai-hong2，MA Jin2，LIAO Shi-qi2*，ZHANG Li-qiong1，WANG Xiao-qing2，MA Jun1

(1.College of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050;2.Institute of Gansu Medical Science Research，Lanzhou 730050，China)

ObjectiveTo screen aptamers to HIV-P24 through SELEX technique for the diagnosis and therapy of AIDS．MethodsWith recombinant P24 for the screening target，oligonucleotides binding to HIV-P24 were screened from a random oligonucleotide library through SELEX technique．The binding capacity between oligonucleotides obtained from the 12th round of screening and HIV-P24 was identified via electrophoretic mobility shift assay(EMSA)．The aptamers strongly binding to HIV-P24 were screened and the recognition specificity of aptamers for HIV-P24 was detected by Dot-blot method．ResultsFive aptamers with high affinity to HIV-P24 were obtained with different sequences．The binding specificity showed that No．18 and No．26 apatmers only bound to HIV-P24，not to human serum albumin，bovine serum albumin and skimmed milk powder．ConclusionsTwo aptamers specially binding to HIV-P24 were obtained，and thus provides an experimental basis for the diagnosis and treatment of AIDS by utilizing aptamer of HIV-P24．

SELEX technique;HIV-P24;aptamer

R 319

A

1001-6325(2012)09-0987-05

2011－08－16

2011－12－05

國家自然科學基金(30271219，30960104，81060180);國家中小企業(yè)創(chuàng)新基金(06C26226200591);甘肅省重大研發(fā)項目(GKSOU-B06-10，GKS031030)

*通信作者(corresponding author):lshiqi@126．com

志謝:衷心感謝甘肅省醫(yī)學科學研究院醫(yī)學分子生物學研究中心的全體員工和同學及蘭州理工大學生命科學與工程學院。