TWEAK和Fn14在腰椎間盤退變髓核組織中的表達及意義

陳春永，沈正清，葉君健*

(1.福建醫科大學附屬第一醫院骨科，福建福州350005;2.福建晉江市醫院骨科，福建晉江362200)

TWEAK和Fn14在腰椎間盤退變髓核組織中的表達及意義

陳春永1，沈正清2，葉君健1*

(1.福建醫科大學附屬第一醫院骨科，福建福州350005;2.福建晉江市醫院骨科，福建晉江362200)

目的 研究TWEAK和Fn14在腰椎間盤退變髓核組織中的表達及其臨床意義。方法 用半定量RT-PCR和免疫組織化學法檢測實驗組(30例退變腰椎間盤)和對照組(10例創傷腰椎間盤)中TWEAK和Fn14mRNA及蛋白表達。結果 實驗組TWEAKmRNA表達顯著高于對照組(0.949±0.093vs0.653±0.110，P＜0.01)，實驗組TWEAK蛋白表達顯著高于對照組(0.682±0.126vs0.397±0.057，P＜0.01)，實驗組Fn14mRNA表達顯著高于對照組(0.936±0.125vs0.632±0.059，P＜0.01)，Fn14蛋白表達顯著高于對照組(0.540±0.051vs0.344±0.072，P＜0.01)。結論 TWEAK和Fn14的表達增加可能參與腰椎間盤退變的進程。

腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑;成纖維細胞因子誘導14;椎間盤;椎間盤退變

腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑(TNF-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)是腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosis factor superfamily，TNFSF)的新成員，最早于1997年報道［1］，具有廣泛的生物學活性，參與了細胞增殖遷移［2－3］、誘導血管生成［5］、炎性反應［5］及誘導凋亡［6］等病理過程。成纖維細胞因子誘導14(fibroblast growth factor-inducible 14，Fn14)為TWEAK的受體。本研究旨在檢測腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation，LDH)患者退變腰椎間盤組織中TWEAK和Fn14的表達，初步探討TWEAK和Fn14與椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)發病的相關性，進而為臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 標本來源

實驗組:腰椎間盤退變髓核組織，取自2009年11月－2010年6月期間在福建醫科大學附屬第一醫院骨科住院手術的LDH患者，有典型臨床癥狀和體征，并經磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)確認，無明顯的全身性免疫性疾病和急慢性感染，共30例(男性19例，女性11例)，平均年齡(49.6±13.0)(16～75)歲。對照組:腰椎間盤創傷髓核組織，取自2009年11月－2010年6月期間在福建醫科大學附屬第一醫院骨科住院手術的腰椎創傷患者，外傷至手術不超過3 d，MRI檢查確認椎間盤無明顯退變，傷前無長期腰腿疼痛、全身性免疫性疾病和明顯的急慢性感染，共10例(男性7例，女性3例)，平均年齡(34.9±11.4)(18～55)歲。兩組標本取材前已告知患者，簽署知情同意書，并經我院倫理委員會審查備案(閩醫大附一科研倫理審［2009］3號)。

1.2 主要試劑

TWEAK兔抗人多克隆抗體(Bioworld公司);Fn14兔抗人多克隆抗體(Abcam公司);抗兔二抗試劑盒(福建邁新生物技術開發有限公司);Trizol與反轉錄試劑盒(Invitrogen公司);PCR試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司);PCR的TWEAK、Fn14及內參引物由上海生工生物技術公司設計合成(表1)。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequence of PCR

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR檢測TWEAK和Fn14mRNA表達:取腰椎間盤髓核組織100 mg在液氮中磨碎，加1 mL Trizol徹底勻漿，經0.2 mL氯仿處理后離心，上清液用異丙醇沉淀，冰預冷DEPC處理水配制的75%乙醇1 mL洗滌沉淀物，棄乙醇，室溫干燥后將沉淀溶于適量 DEPC水中，核酸紫外分析儀檢測，計算RNA純度與濃度，證實純度達要求，用于后續實驗。cDNA合成采用反轉錄試劑盒，將以下組分加入EP管中:1 μL oligo(dT)、2 μL 總 RNA、1 μL 10 mol/L dNTP、8 μL ddH2O;混合物在65 ℃加熱5 min后，迅速置于冰上冷卻。短暫離心后加入以下組分:4 μL第一鏈合成緩沖液、2 μL 0.1 mol/L DTT、1 μL RNaseOUTTM核酸酶抑制劑;在離心管中輕輕將各種成分混合，并在37℃下孵育2 min;室溫下加入1 μL M-MLV反轉錄酶;37℃孵育50 min;70℃加熱15 min以終止反應;馬上進行PCR反應或－20℃保存。以RT反應產物(cDNA)為模板，擴增目的基因片段:建立25 μL的反應體系:2 μL cDNA，12.5 μL MasterMix，各1 μL TWEAK 和 GAPDH 上下游引物，6.5 μL ddH2O。PCR 反應條件:預處理 94℃5 min，58℃ 30 s、72℃ 60 s，30 次循環，72℃7 min。所得PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。Fn14的擴增條件與TWEAK相同。

1.3.2 免疫組織化學SP法檢測TWEAK和Fn14蛋白表達:免疫組化染色按SP法試劑盒說明書步驟進行，切片經脫蠟，微波熱抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，加入一抗多克隆兔抗人TWEAK(或Fn14)、二抗，DAB顯色，蘇木素復染，脫水后透明，中性樹膠封片;空白對照采用PBS代替一抗。

1.4 結果判定

1.4.1 RT-PCR結果判定:采用1.2%瓊脂糖凝膠，加入8 μL的PCR反應產物進行電泳，電壓110 mV，22 min，紫外透射儀下觀察并拍攝PCR特異性產物，通過PCR擴增片段條帶位置與MarkerⅠ進行比較，判斷擴增片段的正確性。計算機圖像處理，測定各個條帶的吸光度值，以目的基因與內參照的吸光度比值為半定量資料，進行統計分析。

1.4.2 免疫組化結果判定標準:TWEAK和Fn14主要為胞質表達，胞質著色呈棕黃色者為陽性細胞，淡黃色為弱陽性，不著色為陰性;切片用Ipp6.0軟件測吸光度作圖像分析。

1.5 統計學分析

數據用均值 ±標準差(±s)表示，應用SPSS13.0統計軟件進行兩樣本均數t檢驗和簡單相關分析。

2 結果

2.1 TWEAK和Fn14 mRNA在創傷及退變腰椎間盤中的表達

創傷及退變組椎間盤髓核組織均有TWEAK和Fn14mRNA的表達，退變組TWEAK和Fn14mRNA的表達明顯高于創傷組(P＜0.01)(圖1，2)。退變組TWEAK和Fn14的表達具有正相關性(P＜0.01)(圖3)。

圖1 創傷組及退變組TWEAK和Fn14 mRNA的表達Fig 1 Expression of TWEAK and Fn14 mRNA in the control group and the experimental group

圖4 腰椎間盤髓核組織TWEAK和Fn14免疫組化染色Fig 4 Expression of TWEAK and Fn14 in different pulpy nucleus tissues of lumbar discs by immunohistochemistry staining(×400)

2.2 TWEAK和Fn14蛋白在創傷及退變腰椎間盤中的表達

TWEAK和Fn14蛋白在創傷組及退變組腰椎間盤中均有表達，退變組腰椎間盤中的表達明顯高于創傷組腰椎間盤(P＜0.01)(圖4，5)。退變組TWEAK和Fn14的表達具有正相關性(P＜0.01)(圖3)。

3 討論

圖5 創傷組和退變組椎間盤髓核組織TWEAK和Fn14蛋白表達的比較Fig 5 Comparison of expression of TWEAK and Fn14 protein in pulpy nucleus tissues of lumbar disc in control group and experimental group

TWEAK是一種Ⅱ型膜蛋白，合成之初沒有活性，經furin蛋白酶切割后分泌到細胞外，成為具有生物學活性的可溶性片段［7］。Fn14是一種Ⅰ型膜蛋白，為TWEAK的受體，其參與信號傳導的機制尚未完全闡明。目前對Fnl4的研究表明，該受體本身不具有蛋白激酶活性，是通過接頭分子(adaptor molecules)將其與下游信號傳導分子聯系起來。腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)相關因子家族(TNF receptor-associated factors，TRAF)是聯系Fnl4和下游信號傳導通路的一組重要接頭分子［8］。當可溶性TWEAK作用于Fnl4陽性細胞株后，可通過 TRAF活化核轉錄因子(NF-κB)、細胞外信號調節激酶(extracellular signalregulated kinase，ERK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號傳導通路［9］。TWEAK是否還激活其他信號傳導通路目前尚不明確。

椎間盤的退變與各種炎性反應介質有關，包括一氧化氮(nitric oxide，NO)、白細胞介素(interleukins，IL)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor receptor，TNF)及其他細胞因子［10］。MMP-3 對椎間盤的破環作用至少包括兩條途徑:首先為直接降解椎間盤細胞外基質;其次，MMP-3在血管生成方面具有重要作用，而后者是腰椎間盤退變的重要特征［11］。TNF-α 和 IL-1β 可增加 MMP-3、MMP-13、促炎性反應酶類、誘導型一氧化氮合酶等促分解代謝蛋白酶的轉錄，而對Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖、連接蛋白等基質蛋白的轉錄則明顯抑制［12］。

本研究發現，在正常人腰椎間盤髓核組織中有TWEAK、Fn14mRNA和蛋白的表達，而在退變腰椎間盤髓核組織中的表達明顯增加，而且TWEAK、Fn14mRNA和蛋白的表達呈現正相關性。提示TWEAK和Fn14是腰椎間盤退變的重要調節因子，TWEAK和Fn14的表達增加可能參與腰椎間盤退變的進程。有動物研究表明TWEAK通過阻斷前體成骨和軟骨細胞分化來阻止椎間盤的內源性修復。TWEAK和Fn14結合可誘導椎間盤細胞合成MMP-3。這種誘導作用可被TWEAK及Fn14的中和蛋白終止。也可被c-Jun氨基端激酶(JNK)抑制劑抑制，說明TWEAK和Fn14結合誘導MMP-3表達的信號傳導通過JNK途徑。TWEAK也可直接促進椎間盤外基質聚集蛋白聚糖的分解［13－14］。Huh等［15］取人椎間盤髓核培養研究，TWEAK 100 ng/mL即可明顯降低了椎間盤髓核Sox9和聚集蛋白聚糖mRNA的表達水平，加入Fn14 500 ng/mL共培養，則Sox9和聚集蛋白聚糖mRNA的表達水平進一步下降。表明TWEAK即可與Fn14結合發揮作用，也可以其他的方式起作用。TWEAK和Fn14在人退變腰椎間盤髓核表達增加的原因和機制目前還不清楚，可能與負荷、損傷及各種細胞因子有關，有待進一步研究。

［1］Chicheportiche Y，Bourdon PR，Xu H，et al．TWEA K，anew secreted ligand in the tumor necrosis factor family thatweakly induces apoptosis［J］．J Biol Chem，1997，272:32401－32410．

［2］Sugito T，Mineshiba F，Zheng C，et al．Transient TWEAK overexpression leads to a general salivary epithelial cell proliferation［J］．Oral Diseases，2009，15:76 －81．

［3］Haile WB，Echeverry R，Wu JT，et al．The interaction between tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis and its receptor fibroblast growth factor-inducible 14 promotes the recruitment of neutrophils into the ischemic brain［J］．Cerebral Blood Flow Metabolism，2010，30:1147 －1156．

［4］Donohue PJ，Richards CM，Brown SA，et al．TWEAK is an endothelial cell growth and chemotactic factor that also potentiates FGF-2 and VEGF-A mitogenic activity［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23:594 －600．

［5］Kamijo S，Nakajima A，Kamata K，et al．Involvement of TWEAK Fn14 interaction in the synovial inflammation of RA［J］．Rheumatology，2008，47:442 －450．

［6］Yanaba K，Yoshizaki A，Muroi E，et al．Elevated circulating TWEAK levels in systemic sclerosis association with lower frequency of pulmonary fibrosis［J］．J Rheumatology，2009，8:1657－1662．

［7］Lynch CN，Wang YC，Lund JK，et al．TWEAK induces angiogenesis and proliferation of endothelial cells［J］．J Biol Chem，1999，274:8455 －8459．

［8］Han S，Yoon K，Lee K，et al．TNF related weak inducer of apoptosis receptor，a TNF receptor superfamily member，activates NF-kappa B through TNF receptor-associated factors［J］．Bioehem Biophys Res Commun，2003，305:789 －796．

［9］Winkles JA，Tran NL，Brown SA，et al．Role of TWEAK and Fnl4 in tumor biology［J］．Front Biosci，2007，12:2761 －2771．

［10］Podichetty VK．The aging spine:the role of inflammatory mediators in intervertebral disc degeneration［J］．Cell Mol Biol，2007，53:4 －18．

［11］Weiler C，Nerlich AG，Zipperer J，et al．2002 SSE A-ward competitionin basic science:expression of major matrix metalloproteinases is associated with intervertebral disc degradation and resorption［J］．Eur Spine J，2002，11:308－320．

［12］Stevens AL，Wheeler CA，Tannenbaum SR，et al．Nitric oxide enhances aggrecan degradation by aggrecanase in response to TNF-alpha but not IL-1beta treatment at a posttranscriptional level in bovine cartilage explants［J］．Osteoarthritis Cartilage，2008，16:489 －497．

［13］Wako M，Haro H，Ando T，et al．Novel Function of TWEAK in Inducing Intervertebral Disc Degeneration［J］．J Orthopaedic Res，2007，25:1438 －1446．

［14］Wako M，Ohba T，Ando T，et al．Mechanism of signal transduction in tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis-induced matrix degradation by MMP-3 upregulation in disc tissues［J］．Spine，2008，33:2489 －2494．

［15］Huh H，Lee YJ，Kim JH，et al．Effects of TWEAK，Fn14，and TGF-β1 on degeneration of human intervertebral disc［J］．J Korean Neurosurg Soc，2010，47:30－35．

Expression and significance of TWEAK and Fn14 in the degenerated and traumatic lumbar discs

CHEN Chun-yong1，SHEN Zheng-qing2，YE Jun-jian1*

(1.Dept．of Orthopaedics，the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350005;2.Dept．of Orthopaedics，Jinjiang Municipal Hospital of Fujian Province，Jinjiang 362200，China)

ObjectiveTo investigate the expression of TWEAK and Fn14 in nucleus pulposus of human degenerated lumbar discs and to evaluate the clinical significance．MethodsmRNA and protein expression of TWEAK and Fn14 in the experimental group(30 fresh pulpy nucleus of patients with lumbar disc herniation)and the control group(10 fresh pulpy nucleus of patients with traumatic lumbar vertebrae)were detected by semi-quantitative RTPCR and immunohistochemical staining．ResultsmRNA expression ofTWEAKwas significantly higher in the experimental group when compared with that of the control group(0.949±0.0931vs0.653±0.110，P＜0.01);It was same to TWEAK protein(0.682±0.126vs0.397±0.057，P＜0.01);Fn14mRNA(0.936±0.125vs0.632±0.059，P＜0.01);and Fn14 protein(0.540±0.051vs0.344±0.072，P＜0.01)．ConclusionsThe increased expression of TWEAK and Fn14 in degenerate lumbar discs indicates that TWEAK and Fn14 may be involved in the process of lumbar intervertebral disc degeneration(IDD)．

tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis;fibroblast growth factor-inducible 14;intervertebral disc;intervertebral disc degeneration

R 681.5

A

1001-6325(2012)09-1053-06

2010－11－02

2011－12－09

福建省自然科學基金(C0710010);福建醫科大學教授基金(JS09007)

*通信作者(corresponding author):yejunjian@medmail．com．cn