筋脈通含藥血清降低高糖培養大鼠雪旺細胞活性氧水平及PARP-1蛋白表達

石 玥，梁曉春*，張 宏，王普艷，趙 麗

(中國醫學科學院北京協和醫學院1.北京協和醫院中醫科轉化醫學中心，北京100730;2.基礎醫學研究所細胞中心，北京100005)

筋脈通含藥血清降低高糖培養大鼠雪旺細胞活性氧水平及PARP-1蛋白表達

石 玥1，梁曉春1*，張 宏2，王普艷1，趙 麗1

(中國醫學科學院北京協和醫學院1.北京協和醫院中醫科轉化醫學中心，北京100730;2.基礎醫學研究所細胞中心，北京100005)

目的 研究筋脈通含藥血清對體外高糖培養雪旺細胞活性氧(ROS)水平及多聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)蛋白表達的影響。方法 30只雄性SD大鼠隨機分為3組，分別灌胃筋脈通(JMT)、維生素C(VC)或蒸餾水制備含藥血清和對照血清。取新出生大鼠的雙側坐骨神經用于制備雪旺細胞，分為高糖組、JMT組(加入筋脈通含藥血清)、VC組(加入維生素C含藥血清)及正常對照組。培養48 h后，采用激光掃描共聚焦顯微技術檢測細胞內二氯熒光黃(DCF)的熒光強度而測得細胞內ROS水平;采用免疫印跡法(Western blot)檢測細胞PARP-1(89 ku)的蛋白表達。結果 1)高糖組雪旺細胞ROS-DCF熒光值(86.59±8.14)顯著高于正常值(P＜0.01);筋脈通含藥血清組(44.58±8.67)與維生素C含藥血清組(46.12±8.80)均顯著低于高糖組(P＜0.01)。2)與正常組比較，高糖組雪旺細胞內PARP-1(89 ku)含量(0.712±0.012)明顯增加(P＜0.01);與高糖組比較，筋脈通含藥血清組含量(0.307±0.025)明顯降低(P＜0.01)，且明顯優于維生素C組(0.594±0.017)(P＜0.01)。結論 筋脈通含藥血清能顯著減少ROS生成，降低PARP-1的活性和酶解，減輕細胞DNA氧化損傷。

雪旺細胞;高糖;氧化應激損傷;PARP-1;筋脈通

糖尿病周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常見的慢性并發癥之一，文獻報道患病率達40% ～90%，是導致糖尿病患者足潰瘍或非創傷性截肢最常見的原因［1］。雪旺細胞(Schwann cell，SC)作為周圍神經系統特有的膠質細胞，具有形成髓鞘和促進軸索生長及再生的作用，SC因氧化應激而發生細胞凋亡是導致上述DPN病理改變的重要原因之一。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP ribose polymerase-1，PARP-1)是一類催化聚ADP核糖化的核酶，廣泛存在于除酵母外所有真核細胞中，具有修復DNA損傷、調控基因轉錄、促細胞分裂和維持染色質及基因組穩定等生理功能［2］。有研究發現，PARP在抗氧化應激，保護雪旺細胞，改善糖尿病周圍神經病變過程中發揮著重要的作用［3］。本研究既往研究已證實中藥筋脈通可以增進高糖培養SC的增殖，促進其分泌神經生長因子［4］，具有降低 NF-κB 的蛋白及其 mRNA 的表達［5］等作用。本實驗進一步探討筋脈通對雪旺細胞ROS水平及PARP-1蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:SPF級出生3～5 d的SD雄性乳鼠以及出生6～8周雄性SD大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號:京2007-0001)。前者用于雪旺細胞原代培養，后者用于含藥血清的制備。

1.1.2 實驗藥物:筋脈通膠囊(由菟絲子、女貞子、水蛭、桂枝、元胡及細辛等組成)，中國醫學科學院北京協和醫院院內制劑，每粒含生藥0.35 g，批準文號(97)京衛藥制加字［48］第F-292號，生產批號061019。維生素C(Vitamin C，VC)(北京雙鶴藥業股份有限公司)，0.1 g/片，批準文號國藥準字H11021503，生產批號080213。

1.1.3 主要試劑:胎牛血清蛋白、細胞培養基(DMEM)和0.05%胰蛋白酶(Hyclone公司)，HEPES(Amresco公司)，L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉和活性氧檢測試劑盒(Sigma公司)，Cleaved-PARP-1(89 ku)多克隆抗體(CST)、FITC標記山羊抗大鼠IgG、一抗稀釋液和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)，DNaseI(Takara公司)，兔抗鼠S-100多克隆抗體(武漢博士德公司)，豬抗兔熒光二抗/FITC(Dako公司)Triton-X100(Nacayouitesuwa株式會社)，ENMED(Scientifics公司)，EDTA(北京化學試劑公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 含藥血清及正常大鼠血清的制備:隨機將大鼠分為筋脈通含藥血清組、維生素C含藥血清組以及正常組，適應性喂養24 h后開始每天2次灌胃。筋脈通組按成人劑量的15倍給藥，即1.312 5 g/kg;維生素 C組按成人劑量的 15倍給藥，即0.075 g/kg;正常組予同等體積蒸餾水，連續3 d。于末次灌胃后2 h內進行血液采集。腹腔注射12%烏拉坦(1 mL/100 g BW)麻醉，無菌條件下頸總動脈取血，室溫靜置2 h后，4 000 r/min離心10 min，分離血清，56℃水浴滅活30 min，分裝，置-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 SC的原代培養、純化、傳代以及鑒定:無菌條件下，取新生5～8 d乳鼠，切取雙側坐骨神經，D-Hank's漂洗后將組織剪碎至1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm左右小塊，均勻接種于含胎牛血清20%的DMEM培養基中，5%37℃ CO2培養箱中培養。48 h后首次換液，2～3 d換液1次。當細胞生長到覆蓋瓶底壁的80%以上時，D-Hank's液沖洗，加入0.05%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化約3～5 min，離心棄上清，完全培養基重懸，接種于T25培養瓶，差速貼壁30 min后收集細胞懸液，以1×105個細胞/mL濃度接種于T25培養瓶，37℃ CO2培養箱中繼續培養。當細胞匯合程度達80% ～90%時即可進行傳代，吸去原培養液，D-Hank's液沖洗，消化，計數后稀釋至濃度為(2～4)×105cells/mL進行傳代。取第3代生長良好的細胞，進行S-100蛋白免疫組織化學鑒定，胞質顯棕黃色者為陽性細胞。

1.2.3 分組及含藥血清干預:根據本實驗既往研究結果，設定50 mmol/L葡萄糖為高糖濃度，1∶2稀釋筋脈通含藥血清、1∶1維生素C含藥血清作為理想干預條件，藥物作用后的第48小時為觀察點。綜合分析不同濃度筋脈通含藥血清干預后SC的生長曲線與細胞形態，分為1)正常對照組(Con):DMEM培養基+20%正常大鼠血清;2)高糖對照組(Glu):DMEM(50 mmol/L Glu)培養基+20%正常大鼠血清;3)筋脈通(JMT)組:DMEM(50 mmol/L Glu)培養基+10%筋脈通含藥血清+10%正常大鼠血清;4)維生素C(VC)組:DMEM(50 mmol/L Glu)培養基+20%VC含藥血清。

1.2.4 免疫熒光技術檢測筋脈通含藥血清對高糖培養SC活性氧水平的影響:取第3代SC進行消化，按上述分組所配制的條件培養液稀釋成細胞懸液，按1×105細胞/孔的濃度接種于置有蓋玻片的6孔板內，置5%CO237℃培養箱培養48 h。PBS漂洗后加入熒光探針 DCFH-DA(1∶1 000)，10～20 μL/片，37℃濕盒內孵育30 min。陰性對照組以0.01 mol/L PBS代替一抗。PBS液振洗后GENMED封片處理液封片，于激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)掃描。探測FITC熒光強度，激發光為488 nm，發射光為525 nm。CLSM下觀察并照相，所攝圖像以 Leica Confocal圖像分析軟件檢測綠色熒光強度，每組計數15～20個細胞。

1.2.5 Western blot檢測雪旺細胞PARP-1(89 ku)蛋白表達:1)細胞總蛋白的提取，接種SC于6孔板中，當細胞匯合至70% ～80%時，PBS沖洗，每孔加入100 μL細胞裂解液，細胞刮刀刮下貼壁細胞轉移至微量離心管中渦旋振蕩器振蕩，使細胞充分裂解，收集懸液，4℃ 12 000 r/min離心10 min，吸取上清，-80℃保存。2)BCA法測定總蛋白濃度，PBS溶液稀釋待測蛋白樣品(5倍稀釋)，取BCA試劑盒A液和B液適量以50∶1的比例混勻形成淺綠色工作液。將50 μL不同濃度梯度的BSA標準品及稀釋好的待測蛋白樣品分別與400 μL工作液混合，37℃水浴反應30 min。將反應后的蛋白溶液，分別取200 μL(每個標準品或樣品設置二個重復孔)加入到96孔板中，振蕩30 s。酶標儀單波長570 nm測A值，繪標準曲線。待測樣品濃度通過計算標準曲線公式獲得。3)SDS-PAGE、蛋白質印跡、ECL顯色反應，計算蛋白上樣體積，將蛋白與5×上樣緩沖液按體積比1∶4混合，100 ℃沸水煮5 min，12 000 r/min離心10 min，使蛋白內絮狀物充分沉淀。按順序吸取蛋白樣品(50 μg總蛋白)至加樣孔內，進行電泳。開始電壓為60 V(恒壓)，待染料進入分離膠后，將電壓增加到100 V，繼續電泳直到染料抵達分離膠底部。

SDS-PAGE結束后，冰浴中進行電轉(恒壓60 V)3 h。電轉結束后，麗春紅染液染色，TBS-T漂洗，可見蛋白條帶。標記邊側的蛋白質分子量標準，根據目的蛋白的分子質量對轉印膜進行裁剪。將標記好的轉印膜經TBS-T漂洗，加入適量封閉液中，室溫輕搖30 min。將轉印膜放入雜交袋內，按0.1 mL/cm2加入抗體稀釋液(3%BSA/PBS)、PARP-1(89 ku)抗體和β-actin抗體(1∶1 000稀釋)。于4℃搖床上輕搖過夜。TBS-T漂洗，加入抗體稀釋液后加入兔抗鼠HRP-IgG，室溫輕搖1 h，TBS-T漂洗。

各取等體積ECL試劑A液、B液混合，將ECL混合液加到轉印膜上，反應1 min，將轉印膜連同黑色背景進行曝光拍照，保存電子格式Tiff結果。

1.3 統計學分析

采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析及處理。分析前采用One Sample Kolmoglrov-Smirnov Z test檢驗數據是否符合正態分布，符合正態分布的數據采用均數±標準差(±s)描述，多組獨立樣本比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA);非正態分布數據采用非參數檢驗方法(k個獨立樣本的檢驗)。

2 結果

2.1 筋脈通含藥血清對高糖培養雪旺細胞內ROS水平的影響

陽性對照組活性氧試劑盒綠色熒光表達最強;高糖組表達比陽性對照組稍弱;VC組和JMT組亦可見表達，但都較高糖組弱;而正常對照組(Con)與陰性對照組僅見模糊細胞影，染色不明顯。高糖組SC中ROS-DCF的熒光強度顯著高于正常對照組(P＜0.01)。JMT組及VC組ROS-DCF的熒光強度值均較Con組顯著增高(P＜0.01)，較高糖組顯著降低(P＜0.01)(表1)。

表1 筋脈通含藥血清對高糖培養雪旺細胞ROS表達的影響Table 1 Effect of Chinese herbal medicine Jinmaitongmedicated serum on the expression of ROS in Schwann cell cultured in high-glucose medium(±s)

表1 筋脈通含藥血清對高糖培養雪旺細胞ROS表達的影響Table 1 Effect of Chinese herbal medicine Jinmaitongmedicated serum on the expression of ROS in Schwann cell cultured in high-glucose medium(±s)

*P ＜0.01，＊＊P ＜0.01 compared with control group;#P ＜0.01，##P＜0.01 compared with high glucose group.

group ROS-DCF fluorescent intensity control 4.59±2.95 50 mmol/L Glu 86.59±8.14＊＊JMT 44.58±8.67*#VC 46.12±8.80＊＊##

圖1 各組高糖培養SC內PARP-1蛋白表達的結果Fig 1 Expression of PARP-1(89 ku)among each group in Schwann cell cultured in high-glucose medium

2.2 筋脈通含藥血清對高糖培養雪旺細胞PARP-1表達的影響

免疫印跡法(Western blot)檢測高糖培養SC內PARP-1結果顯示(圖1，表2):Con組大鼠坐骨神經在89ku處出現輕淡條帶，濃度與本底接近，其余各組均在89 ku出現明顯條帶。密度掃描分析顯示:與Con組比較，高糖組SC內PARP-1的IA值明顯增加(P＜0.01)，JMT組及VC組SC內PARP-1 IA值均較Con組顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)。與高糖組比較，JMT組 SC內PARP-1 IA值顯著降低(P＜0.01);VC組SC內PARP-1 IA值亦顯著降低(P＜0.05)。治療組間比較，JMT組SC內PARP-1 IA值明顯低于VC組(P＜0.01)。

表2 各組高糖培養SC內PARP-1蛋白表達IA值比較Table 2 IA of the expression of PARP-1 among each group in Schwann cell cultured in highglucose medium(±s)

表2 各組高糖培養SC內PARP-1蛋白表達IA值比較Table 2 IA of the expression of PARP-1 among each group in Schwann cell cultured in highglucose medium(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 compared with control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 compared with high glucose group;▲P ＜0.01 compared with VC group.

group IA of PARP-1 control 0.071±0.013 50mmol/L Glu 0.712±0.012＊＊JMT 0.307 ±0.025*##▲VC 0.594±0.017＊＊#

3 討論

SC作為周圍神經的髓鞘形成細胞，其形態學和生物學改變可直接影響神經再生的微環境，可導致軸索不能生長或再生速度下降［6-7］。當SC暴露在高糖環境中時，葡萄糖順濃度梯度轉運到細胞內部，SC內的高糖狀態可以通過線粒體呼吸鏈和酶氧化以及AGE的堆積等途徑增加ROS的來源［8］。氧化應激損傷時，被激活活化的PARP通過將NAD+中的ADP核糖轉移到核蛋白上而啟動一個能量消耗循環，導致細胞內NAD+和ATP池的耗竭，減慢糖酵解和線粒體呼吸速度，導致細胞功能紊亂發生細胞凋亡。PARP-1是PARP家族中含量最多，功能最重要的一個成員［9］。PARP-1(89 ku)片段具有該酶的自我修飾域和催化域，不具有結合損傷DNA的活性，只保持了PARP酶的基本活性。因此在組織及細胞中發現PARP-1裂解89 ku片段的出現，代表細胞凋亡程序啟動［10］。

中醫認為DPN的主要病機是由于消渴日久，腎陰受損，陰虛內熱，煎熬津液，血黏成瘀，阻滯筋脈;久致陰損及陽，寒凝血滯，氣血不能通達四肢，肌肉筋脈失于濡養所致。中藥筋脈通以“補腎活血、溫筋通絡”為組方依據［11］，遣菟絲子、女貞子、元胡、水蛭、桂枝、細辛等藥味組方而成。菟絲子女貞子共為君藥，菟絲子陰陽雙補，女貞子善滋養肝腎之陰并清虛熱，兩者配伍寓陽中求陰之意，俱補腎之陰陽。

目前臨床常用的抗氧化藥物有維生素C、維生素E和α-硫辛酸。維生素E和α-硫辛酸是脂溶性或醇溶性抗氧化劑，給藥方式與水溶性試驗藥物存在差異，易導致實驗條件偏倚，而水溶性抗氧化劑維生素C與實驗藥物在使用方法上則更趨于一致。維生素C可與O2-、HOO-及 OH-迅速反應，生成半脫氫抗壞血酸［12］，清除單線態氧，還原硫自由基，抑制動脈內皮細胞產生脂質過氧化，促進前列環素2合成，發揮延緩細胞凋亡和抗氧化作用［13］，故本研究選擇水溶性抗氧化劑維生素C作為本實驗的陽性對照藥物。本次研究的結果顯示，筋脈通和維生素C含藥血清組均能削弱SC內ROS熒光探針的表達強度，在細胞水平上二者抗氧化能力接近。進一步對DNA氧化損傷致細胞凋亡途徑中的關鍵環節進行檢測，發現筋脈通能夠明顯降低PARP-1的過度表達，抑制細胞凋亡的發生，作用優于維生素C?，F代藥理研究認為菟絲子中含有多種抗氧化作用的活性成分，包括槲皮素、紫云英甙、金絲桃甙和槲皮素-3-O-β-半乳糖-7-O-β-葡萄糖甙等。而女貞子中發揮抗氧化作用的主要成分為槲皮素和紅景天苷。槲皮素在體內外對各種自由基的清除作用已被許多實驗證明。通過磷鉬法測定其總抗氧化能力(TAC)，發現其在pH 7-9.5之間與水溶性維生素E相當，約3倍于姜黃素［14］。槲皮素的抗氧化應激作用明顯強于蘆丁、白藜蘆醇、柚皮素等其他黃酮類化合物，成為抗氧化應激天然藥物的優先選擇［15］。另一方面，雖然筋脈通含藥血清與VC抗氧化應激能力相當，但是在抑制PARP-1方面卻表現了明顯優勢，可能與中藥復方制劑多靶點多途徑作用相關，提示筋脈通復方制劑可能通過其他途徑抑制神經細胞凋亡，有待我們進一步的研究闡釋。

綜上所述，筋脈通可以有效減少ROS的生成，減輕DNA氧化損傷，并抑制DNA損傷感受器PARP的活性和酶解，從而阻止細胞凋亡程序的執行。這可能是中藥筋脈通防止神經組織結構破壞，起到對周圍神經保護作用的途徑之一。

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Effects of Chinese herbal medicine Jinmaitong-containing serum on the ROS level and expression of PARP-1 of rat Schwann cells cultured in high-glucose medium

SHI Yue1，LIANG Xiao-chun1*，ZHANG Hong2，WANG Pu-yan1，ZHAO Li1

(1.Dept.of Traditional Chinese Medicine，Translational Medicine Center，PUMC Hospital，CAMS ＆ PUMC，Beijing 100730;2.Institute of Basic Medical Sciences，CAMS ＆ PUMC，Beijing 100005，China)

ObjectiveTo investigate the effects of medicated serum prepared by administration of Jinmaitong(JMT)，a compound Chinese herbal medicine，on oxidative damage and poly ADP-ribose polymerase-1(PARP-1)of Schwann cells cultured in high-glucose medium.MethodsSD rats were divided into normal control group(distilled water)，JMT group and vitamin C group to prepare medicated serum.Bilateral sciatic nerves of new born SD rats were used to separate Schwann cells.Schwann cells cultured in high-glucose medium were divided into high glucose group(50 mmol/L glucose medium，JMT group(JMT-medica-ted serum)and vitamin C(VC)group(VC-medicated serum).Schwann cells cultured in DMEM were used as the normal control.After 48 h culturing，the level of ROS was measured by confocal laser scanning microscope with 2'，7'-dichlorofluorescein(DCF)as a molecular probe and the expression of PARP-1 protein was detected by Western blot.Results1)Compared with high glucose group，the fluorescence intensities of ROS-DEC in Schwann cells cultured in JMT and VC groups were weaker significantly(P＜0.01).There were no significant differences between these two treated groups.2)Compared with high glucose group，the expression of PARP-1(89 ku)in Schwann cells cultrued in JMT group decreased significantly(P＜0.01).The expression of JMT group was also much lower than that of VC group(P＜0.01).ConclusionsThe medicated serum of JMT down-regulates the expression of ROS and PARP-1 of Schwann cells cultured in high glucose medium and reduces the oxidative DNA damage.

Schwann cell;high glucose;oxidation damage;PARP-1;Jinmaitong capsule

R 2

A

1001-6325(2012)09-1059-05

2011-10-31

2011-12-26

北京市自然科學基金(7082077)

*通信作者(corresponding author):xcliang@vip.sina.com