福辛普利抑制LPS誘導的人腎小管上皮HK－2細胞TAK1表達

黃文輝，盧守燕*，湯 羽

(甘肅省人民醫院1.腎內科;2.檢驗科，甘肅蘭州730000)

福辛普利抑制LPS誘導的人腎小管上皮HK－2細胞TAK1表達

黃文輝1，盧守燕1*，湯 羽2

(甘肅省人民醫院1.腎內科;2.檢驗科，甘肅蘭州730000)

目的 探討福辛普利(FOS)對脂多糖(LPS)誘導的人腎小管上皮細胞(HK-2)增殖及對轉化生長因子β激活激酶(TAK1)表達的影響。方法 體外培養正常HK-2細胞，分為3組:對照組(Ctrl)、LPS誘導組(10 μg/L)、FOS干預組(LPS 10 μg/L+FOS 1×106mol/L)。細胞培養12、24和48 h，以甲基噻唑基四唑(MTT)法檢測細胞增殖情況，酶聯免疫吸附(ELISA)法觀察細胞上清纖維黏連蛋白(FN)變化，Western blot法檢測TAK1、FN蛋白表達，實時熒光定量PCR檢測TAK1mRNA的含量。結果 LPS誘導組較對照組細胞的增殖水平(在48 h分別為0.462±0.013及0.363±0.014)、胞質中FN的含量均顯著增高，且自12 h開始TAK1蛋白(在48 h分別為1.627±0.101及0.547±0.010)及mRNA表達水平上調(P＜0.01，P＜0.05)，FOS干預組細胞增殖(在48 h為0.396±0.011)、FN的含量及TAK1的表達(在48 h蛋白表達為1.308±0.097)較同時間點LPS組(在48 h蛋白表達為1.627±0.101)顯著下調(P＜0.01)。結論FOS可能通過抑制HK-2的增生與活化，減輕細胞外基質FN的沉積，起到延緩腎間質纖維化的作用。

福辛普利;人腎小管上皮細胞;轉化生長因子β激活激酶;腎間質纖維化

許多研究表明，在各種慢性腎臟疾病進展過程中，腎小管上皮細胞、腎間質成纖維細胞等腎間質細胞在各種細胞因子的作用下，相互促進腎小管間質纖維化的發生與發展［1］。其中轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是重要的致纖維化因子，可以促進小管上皮細胞分泌細胞外基質包括纖維連接蛋白(fibronectin，FN)的產生［2］。而轉化生長因子β激活激酶(TGFβ-activated kinase 1，TAK1)是TGF-β1下游信號分子，是絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族成員之一，與許多疾病的發生發展有關［3］。血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotension converting enzyme inhibitors，ACEI)福辛普利(fosinopril，FOS)已被大量腎臟疾病動物模型及臨床研究證實，其具有延緩腎功能惡化、保護腎臟的作用［4］，然而關于FOS對人腎小管上皮細胞(human renal tubular epithelial cells，HK-2)作用的研究較少。因此，本研究觀察FOS對脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導下HK-2增殖、分泌細胞外基質FN及對TAK1表達的影響，探討FOS腎保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑:福辛普利(上海施貴寶公司);優級胎牛血清(杭州四季青公司)，F12/DMEM(1∶1)培養液、Hepes、胰蛋白酶(Gibco 公司)，纖維連接蛋白(FN)ELISA試劑盒(ADL公司)，脂多糖(LPS)(Sigma公司)，Trizol(Invitrogen公司)，兔抗大鼠TAK1多克隆抗體、鼠抗FN、β-actin單克隆抗體(Cell Signaling公司)，HRP標記羊抗兔、抗鼠IgG二抗(Santa Cruz公司)，PVDF Western轉印膜、ECL Plus化學發光試劑盒(Millipore公司)，RIPA裂解液(北京普利萊公司)，PCR引物(上海英駿公司)。

1.1.2 動物與細胞:清潔級雄性Wistar大鼠10只，體質量160～180 g，由蘭州大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK(甘)2004-2006。正常人近端腎小管上皮細胞系HK-2由蘭州陸軍總醫院細胞實驗室惠贈。

1.2 含藥血清的制備及HK-2培養

每日灌胃給大鼠福辛普利10 mg/kg，共7 d，獲得含藥血清，對照組給予等體積0.9%氯化鈉注射液，于末次給藥后1h心臟穿刺取血，3 000 r/min離心10 min分離血清，56 ℃水浴30 min滅活，0.22 μm濾膜過濾除菌，－20℃冰箱保存備用。HK-2接種于含10%胎牛血清(FBS)的F12/DMEM(F/D 1∶1)培養液中，37℃ 5%CO2培養箱孵育。細胞生長至80% ～90%匯合時傳代培養，取對數生長期常規消化后以1×105/mL接種于6孔培養板，至亞融合狀態以無血清F/D培養24 h，使細胞進入靜止期，棄舊培養液，加入含相應試劑的10%胎牛血清F/D完全培養液培養。

1.3 細胞分組及樣品收集

將細胞分為3組:對照組(正常培養液)、LPS誘導組(LPS 10 μg/L)以及 FOS 干預組(LPS 10 μg/L+FOS 1×106mol/L)。分別培養12、24 和48 h，以MTT法檢測細胞增殖情況，收集細胞上清液，離心后－80℃保存備用ELISA檢測，收集細胞用于提取蛋白及mRNA。

1.4 指標檢測及方法

1.4.1 細胞增殖實驗:HK-2接種于96孔板，亞融合狀態時同步后按上述分組孵育，實驗重復3次。在各時間點分別加入含1 g/L MTT培養液100 μL孵育4 h，棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO)溶解，對照組直接加DMSO定零點值，充分震蕩后，在酶標儀上用檢測波長570 nm、參考波長630 nm作比色分析，測各孔吸光度值(A)。

1.4.2 ELISA法測定FN含量:按ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，各時間點各組細胞分別取培養上清液100 μL，加入酶標板孔內，依次加入各種試劑，酶標儀492 nm處檢測標準品及樣品A值。

1.4.3 Western印跡檢測細胞TAK1及FN蛋白的表達:各時間點收集各組細胞，加入300 μL含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰浴提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。各組取等量蛋白樣品上樣，加入5×上樣緩沖液12%SDS-PAGE電泳90 min，轉膜(PVDF膜)90 min，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜3次 ×10 min，分別加入一抗(TAK1 1∶500，FN 1∶1 000)搖床4℃過夜，TBST洗 3次 ×10 min，用HRP標記的二抗(1∶5 000)孵育2 h，TBST洗3次×10 min，加入ECL化學發光試劑，X膠片曝光、顯影和定影，對照Marker確定特異性目的條帶，掃描圖像。同一張膜曝光后以0.5%SDS洗脫抗體，再以β-actin抗體(1∶1 000)孵育雜交，作為內參照。以累積吸光度(IA)比值表示表達量(目的蛋白條帶/內參蛋白條帶)。

1.4.4 RT-PCR法檢測細胞TAK1mRNA的表達:收集各時間點各組細胞，Trizol提取總RNA，紫外分光光度儀測定RNA濃度。Rotor-Gene 3000熒光實時定量PCR儀上進行兩步法Real Time PCR反應。2 μg總RNA利用反轉錄酶PrimeScriptTM緩沖液進行反轉錄反應，將 mRNA反轉錄成 cDNA，然后以25 μL體系進行 PCR擴增，擴增條件為:預變性95℃ 10 s，變性95℃ 5 s，退火、延伸60℃ 30 s，共40個循環。PCR引物序列如下:TAK1正義鏈:5'-C CATCCCAATGGCGTATCTTACA-3'，反義鏈:5'-TCAT CCTGGTCCAATTCTGCAA-3'，產物190 bp;β-actin 正義鏈:5'-GCAAGCAGGAGTATGACGAGT-3'，反義鏈:5'-CTGCGCAAGTTAGGTTTTGTC-3'，產 物 112 bp。每個樣本重復3次，以β-actin為內參照，采用相對定量的2－△△CT法分析PCR結果。

1.5 統計學分析

應用SPSS16.0軟件，計量數據用均數±標準差(±s)表示。多組間數據比較采用單因素方差分析，其中兩組間比較用t檢驗。

2 結果

2.1 HK-2細胞增殖情況

與同時間點對照組相比，LPS誘導組細胞明顯增殖，且細胞形態學發生改變，從原有典型的鋪路石樣上皮細胞形態轉變為長梭形，類似于成纖維細胞(P＜0.01，P＜0.05);FOS干預組細胞增殖速度較同時間點LPS組比較明顯減緩(P＜0.01)(表1)。

表1 不同時間MTT檢測各組HK-2細胞增殖情況Table 1 HK-2 proliferation detected by MTT of different groups in different time(±s，A value，n=6)

表1 不同時間MTT檢測各組HK-2細胞增殖情況Table 1 HK-2 proliferation detected by MTT of different groups in different time(±s，A value，n=6)

*P＜0.01，＊＊P＜0.05 compared with control group;#P＜0.01 compared with LPS group．

group 12 hours 24 hours 48 hours control 0.216±0.018 0.285±0.010 0.363±0.014 LPS 0.284±0.016* 0.378±0.014* 0.462±0.013*FOS+LPS 0.241±0.032*# 0.303±0.019＊＊# 0.396±0.011*#

2.2 HK-2細胞培養上清中FN含量檢測

在常規培養條件下，對照組細胞可分泌少量FN;隨著培養時間的延長，LPS組細胞FN含量均有一定程度的增加，且顯著高于同時間點對照組(P＜0.01);FOS干預組細胞FN含量顯著低于同時間點LPS組(P＜0.01)(表2)。

表2 各組HK-2細胞不同時間FN含量的比較Table 2 Comparison of FN levels in HK-2 of different groups in different time(±s，A value，n=8)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.01 compared with LPS group．

group 12 hours 24 hours 48 hours control 0.212±0.014 0.239±0.017 0.249±0.010 LPS 0.311±0.015* 0.377±0.025* 0.518±0.031*FOS+LPS 0.252±0.013# 0.305±0.016# 0.352±0.017#

2.3 HK-2細胞TAK1及FN蛋白的表達

在常規培養條件下，TAK1及FN蛋白在對照組有少量表達，LPS誘導后，各時間點TAK1及FN蛋白表達明顯高于對照組(P＜0.01);FOS干預組在各時間點對LPS誘導的HK-2分泌TAK1及FN表達明顯下降(P＜0.01)(表3，圖1)。

表3 各組HK-2細胞不同時間TAK1和FN蛋白的表達Table 3 TAK1 and FN protein expressions in HK-2 of different groups in different time(±s，n=5)

表3 各組HK-2細胞不同時間TAK1和FN蛋白的表達Table 3 TAK1 and FN protein expressions in HK-2 of different groups in different time(±s，n=5)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.01 compared with LPS group．

items group 12 hours 24 hours 48 hours TAK1/β-actin control 0.546±0.014 0.548±0.0110.547±0.010 LPS 0.674±0.014* 1.069±0.067* 1.627±0.101*FOS+LPS 0.600±0.057# 0.871±0.032# 1.308±0.097#FN/β-actin control 0.242±0.012 0.242±0.020 0.259±0.006 LPS 0.586±0.027* 0.850±0.033* 1.170±0.096*FOS+LPS 0.457±0.025# 0.645±0.033# 0.814±0.029#

圖1 各組細胞不同時間TAK1和FN蛋白的表達Fig 1 Expressions of TAK1 and FN protein in HK-2 of different groups in different time

2.4HK-2細胞TAK1 mRNA的表達

HK-2細胞TAK1mRNA于LPS誘導12 h時表達開始上調，各時間點表達量均顯著高于對照組(P＜0.01);FOS干預組TAK1mRNA表達量與同時間點相比顯著下降(P＜0.01)(表4)。

表4 各組HK-2細胞不同時間TAK1 mRNA的表達Table 4 The expression of TAK1 mRNA in HK-2 of different group in different time(±s，2 －△△CT，n=5)

表4 各組HK-2細胞不同時間TAK1 mRNA的表達Table 4 The expression of TAK1 mRNA in HK-2 of different group in different time(±s，2 －△△CT，n=5)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.01 compared with LPS group．

group 12 hours 24 hours 48 hours control 1.000±0.000 1.046±0.020 1.042±0.027 LPS 1.655±0.032* 2.421±0.217* 3.461±0.215*FOS+LPS 1.355±0.027# 1.559±0.139# 2.593±0.318#

3 討論

腎間質纖維化是常見的腎臟病理過程，腎臟固有細胞中，腎小管上皮細胞在許多因素包括細胞因子的誘導下，可以轉變為肌成纖維細胞，參與腎間質纖維化，TGF-β1被認為是最重要的致纖維化因子之一［5］。由于腎小管上皮細胞的存在，其轉分化過程的進展程度對于腎臟病的預后有著重要意義，故尋找有效的抑制腎小管上皮細胞轉分化及致纖維化因子活化的因素，對于緩解腎臟疾病的進展至關重要。

TAK1最初被認為是MAPKKK家族成員之一，研究證明，在包括LPS、炎性反應因子等各種細胞外刺激的作用下，TAK1的蘇氨酸酪氨酸被雙磷酸化而激活［6］。TAK1通路下游激酶依次被磷酸化激活后的作用底物為一些轉錄因子，可導致多種重要基因產物表達上調，以及細胞表面受體的表達增多［7］。在腎間質纖維化過程中的不同階段，炎性反應因子和相關細胞因子的釋放、ECM的產生、腎小管上皮細胞表型轉化可能有TAK1的參與，但目前這方面的研究較少，本研究應用細胞培養技術，探尋在LPS誘導下HK-2中TAK1的表達，為進一步尋找促纖維化因子提供實驗依據。

FOS是一種新型ACEI，經肝、腎雙通道排泄，可以降低腎小球內壓力，減少尿蛋白，延緩腎功能受損的進展，具有很好的腎保護作用［8］。但FOS對腎臟保護作用的機制尚不完全清楚，既往對FOS保護腎臟作用機制的研究大多是從血流動力學方面著手的，比如FOS可以通過抑制腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)的過度激活，降低血漿和組織中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的生成，達到抗纖維化的作用［9］。

本研究以HK-2為研究對象，觀察FOS對體外培養HK-2增殖及TAK1表達的影響。從PCR及Western印跡結果來看，LPS可誘導HK-2表達TAK1增加，經過FOS干預后，HK-2表達TAK1蛋白及mRNA水平均下降，提示TAK1信號通路在LPS誘導的HK-2細胞增殖中起了重要作用，FOS可能通過影響TAK1信號通路，下調TAK1蛋白及mRNA的表達，從非血流動力學方面起到了腎臟保護作用。

總之，FOS可能通過抑制HK-2的增生與活化，減輕細胞外基質FN的沉積，從而起到延緩腎間質纖維化的作用，但其確切機制仍有待進一步研究。

［1］曹建南，郭漢城，丘昭文，等．MG-132對TGF-β1誘導的人腎小管上皮細胞轉分化與凋亡的影響［J］．中國中西醫結合腎病雜志，2009，10:404－408．

［2］殷薇，肖平，黃安蘭，等．蟲草菌液拮抗人白蛋白致HK-2細胞增殖及TGF-β1、FN表達的影響［J］．中國現代醫學雜志，2009，19:509－512．

［3］Inokuchi S，Aoyama T，Miura K，et al．Disruption of TAK1 in hepatocytes causes hepatic injury，inflammation，fibrosis，and carcinogenesis［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2010，107:844－849．

［4］張翠平，尚勇，符艷敏．福辛普利聯合羅格列酮對早期糖尿病腎病療效觀察［J］．現代醫藥衛生，2009，25:42－43．

［5］謝席勝，劉衡川，樊均明，等．人參皂甙Rb1對轉化生長因子-β1誘導的腎小管上皮細胞p47phox的表達及細胞外基質的影響［J］．四川大學學報:醫學版，2009，40:106－110．

［6］Pang HY，Liu G，Liu GT．Compound FLZ inhibits lipopolysaccharide-induced inflammatory effects via down-regulation of the TAK-IKK and TAK-JNK/p38MAPK pathways in RAW264.7 macrophages［J］．Acta Pharmacol Sin，2009，30:209－218．

［7］Mikkelsen SS，Jensen SB，Chiliveru S，et al．RIG-I-mediated activation of p38 MAPK is essential for viral induction of interferon and activation of dendritic cells:dependence on TRAF2 and TAK1［J］．J Biol Chem，2009，284:10774－10782．

［8］郝志宏，于力，王麗娜，等．福辛普利對大鼠腎小球系膜細胞增殖及轉化生長因子β1表達的影響［J］．中華婦幼臨床醫學雜志，2008，4:21－24．

［9］孟和，安桂鳳．福辛普利對高血壓病腎損害保護作用的療效觀察［J］．藥物與臨床，2009，47:87－88．

Fosinopril suppresses the expression of TAK1 of the human renal tubular epithelial cells induced by LPS

HUANG Wen-hui1，LU Shou-yan1*，TANG Yu2

(1.Dept．of Nephrology;2.Dept．of Clinical Laboratory，Gansu Provincial Hospital，Lanzhou 730000，China)

ObjectiveTo investigate the effects of fosinopril(FOS)on expression of TAK1 and proliferation of the human renal tubular epithelial cells induced by LPS．MethodsHuman renal tubular epithelial(HK-2)cells were divided into three groups:blank control group(Ctrl)，LPS group(10 μg/L)，FOS group(LPS 10 μg/L+FOS 1×106mol/L)．At 12，24，48 hours，HK-2 proliferation was detected by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay．The change of fibronectin(FN)in the supernatants of the cultured HK-2 was detected by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA)．The protein expressions of TAK1 and FN were measured by Western blot．The mRNA expressions of TAK1 was measured by real-time quantitative PCR．ResultsThe cell proliferation and the expression of FN were increased，and the expressions of protein and mRNA of TAK1 in LPS group were upregulating significantly compared with control group from 12 h(P＜0.01，P＜0.05)，but they were downregulating in FOS group compared with LPS group(P＜0.01)．ConclusionsFOS probably delays renal interstitial fibrosis by inhibiting proliferation and activation of HK-2 and decreasing accumulation of extracellular matrix．

fosinopril;human renal tubular epithelial cells;TGFβ-activated kinase 1;renal interstitial fibrosis

R 692.6

A

1001-6325(2012)09-1088-05

2011－08－29

2011－12－26

*通信作者(corresponding author):lsylushouyan@163．com