Candida etchellsii產2(5)－乙基－4－羥基－5(2)－甲基－3(2H)－呋喃酮的影響因素*

馮杰，詹曉北，季新躍，鄭志永，王棟，張麗敏

1(江南大學生物工程學院糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)2(無錫市恒禾工程咨詢設計有限公司，江蘇 無錫，214031)

2(5)-乙基-4-羥基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(簡稱HEMF)主要存在于醬油中，是醬油中的主體香味物質［1］，故稱為醬油酮［2］，具有高強度的甜焦糖醬香特色［3］，是雜環香體類呋喃同系衍生物中極其重要而且用途極為廣泛的香料之一［4］。HEMF可代替天然香料添加在釀造食品如調味料、酒、無酒精飲料及果制品如果醬、果漿、罐頭等食品中，具有加強其天然香味的作用［5］。同時，HEMF是美國食用制造者協會(FEMA)認可的安全食用香料。此外，最近日本學者研究發現HEMF還具有抗腫瘤的活性［6］。

國內目前還沒有關于對發酵法生產HEMF的研究和報道，國際上也鮮有報道。根據文獻報道，張海林等［8］在研究酵母菌產呋喃酮(HDMF和HEMF具有相似的結構和性質)類物質時發現CaCl的添加對酵母菌株產 HDMF有較大的促進作用，Sugawara等［9］研究了酵母菌發酵產味噌的過程中產HEMF，產量在100 ppm以下，并且進一步研究了HEMF的形成機制。Ohata等［3］利用13C同位素示蹤方法發現酵母菌發酵產HEMF的形成機制，主要是由戊糖和游離氨基酸通過美拉德反應產物經過酵母菌產生的酶作用后形成HEMF。

本研究以1株從醬油中篩選得到的產2(5)-乙基-4-羥基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮的耐高鹽度酵母菌株C.etchellsii CICIM Y0600作為研究對象，主要研究了在不同鹽度和添加不同種類氨基酸條件下，菌體生長和產物HEMF合成的變化情況。

1 材料與方法

1.1 菌種

Candida.etchellsii CICIM Y0600，江南大學生化工程與反應器研究室保藏。

1.2 培養基

斜面培養基(g/L):蛋白胨10，葡萄糖 20，酵母粉 5，NaCl 180～240，瓊脂粉 1.5，pH 5.8 ～6.0。

種子培養基(g/L):蛋白胨10，葡萄糖 20，酵母膏 5，NaCl 180～240，pH 5.8～6.0。

發酵基礎培養基(g/L):葡萄糖 75，木糖 25，不同種類氨基酸 5，酵母粉 1，KH2PO410，MgSO4·7H2O 5，NaCl 180 ～240，pH 5.2。

1.3 實驗設備

發酵罐:美國New Brunswick Scientific公司BioflowⅢSystem 7 L發酵罐。

1.4 分析方法

生物量的測定:取菌懸液5 mL，10 000 r/min離心10 min棄上清液后加入5 mL水稀釋后在分光光度計上于600 nm下測定吸光度(結果與干重法比對，換算為g/L)。

智能變電站是基于數字化建設，因此基于智能變電站的硬件是數字的基礎上，通過先進的傳感器和通信網絡，從而實現全景采集變電站信息，和一個全面的數據庫的建立，使變電站自動化操作，維護和智能分析與決策能力實現，進一步提高電力企業的管理水平和適應能力。

還原糖的測定:DNS比色法［10］。

HEMF的測定:高效液相色譜(HPLC)法。條件:高效液相色譜儀為安捷倫1200，色譜柱為安捷倫ZORBAX XDB-C18 柱(150 ×4.6 mm，5 μm)，柱溫25℃;進樣量為20 μL，檢測波長265 nm。流動相流速0.8 mL/min，流動相組成:60%甲醇和40%雙蒸水。

2 結果與分析

2.1 C.etchellsii分批發酵過程曲線

以耐高鹽度的C.etchellsii為研究對象，選擇培養基中的甘氨酸作為氨基酸源，在180 g/L NaCl濃度條件下對其產HEMF進行分批發酵研究，結果如圖1所示。

圖1 180 g/L NaCl濃度下C.etchellsii生長和產HEMF過程曲線

由圖1中的C.etchellsii生長和產HEMF過程曲線可知，菌體生長分為3個階段，0～4 h為菌體生長的遲滯期，此后4～40 h菌體生長處于對數期，產物HEMF開始產生，在40 h后菌體生長進入穩定期，最大菌體干重為11.11 g/L，而產物HEMF在120 h達到最大值57.74 mg/L。

2.2 不同NaCl濃度對C.etchellsii產HEMF影響

張海林等［8］在研究酵母菌產呋喃酮(HDMF和HEMF具有相似的結構和性質)類物質時發現，NaCl的添加對酵母菌株產HDMF有較大的促進作用。由于本研究中C.etchellsii篩選自高鹽稀態發酵醬油中，該類型醬油中的NaCl濃度為180～240 g/L，故在發酵基礎培養基中補充5 g/L甘氨酸，然后分別向發酵體系中添加180 g/L，200 g/L，220 g/L和240 g/L NaCl，考察NaCl濃度對C.etchellsii合成HEMF的影響。選擇發酵140 h時結束并分別對其生物量和HEMF產量進行測定，結果如表1所示。

由表1可以看出，在200 g/L NaCl濃度條件下，菌體濃度最高，而在220 g/L NaCl濃度條件下，HEMF產量和對菌體濃度的產物得率最高。這說明菌體生長和產物合成的最適條件不一致，這種情況下通常采用分階段調控的策略，最大程度的同時滿足菌體生長和產物合成需要。

選擇初始的NaCl濃度為200 g/L，在發酵20 h，40 h和60 h分別補加NaCl至220 g/L，發酵140 h時結束并測定結果，如表2所示。

由表2中的數據分析可知，選擇初始200 g/L NaCl濃度，在發酵20 h，40 h和60 h分別補加NaCl至220 g/L后，發酵至140 h測得HEMF最終發酵產量分別為76.79 mg/L，98.11 mg/L和89.28 mg/L。可見，利用兩階段添加NaCl策略在發酵40 h時補加NaCl在保證最大菌體濃度的同時，HEMF產量最高。

2.3 添加不同氨基酸對C.etchellsii產HEMF影響

Ohata等［3］利用13C同位素示蹤方法發現酵母菌發酵產HEMF的形成機制，主要是由戊糖和游離氨基酸通過美拉德反應后的產物經過酵母菌產生的酶作用后形成HEMF。因此，氨基酸的添加對HEMF的合成有影響。為了考察氨基酸對C.etchellsii合成HEMF的影響，選擇200 g/L NaCl為條件，分別選擇20種游離氨基酸為氨基酸源對其產HEMF進行研究，在發酵140 h時對其菌體濃度和HEMF含量進行測定，結果如圖2所示。

圖2 添加不同氨基酸對C.etchellsii產HEMF影響結果

由圖2中20種游離氨基酸對 C.etchellsii產HEMF影響結果可知，除酪氨酸(Tyr)對C.etchellsii產HEMF有抑制作用外，其他19種氨基酸對其產HEMF均有不同程度的促進作用，其中，丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)和賴氨酸(Lys)的促進作用最明顯，在這4種條件下，HEMF的產量分別為76.77 mg/L、97.85 mg/L、88.45 mg/L 和 67.11 mg/L。

以添加不同氨基酸對C.etchellsii產HEMF影響為基礎，選擇200 g/L NaCl濃度，進一步考慮不同種類的氨基酸組合對C.etchellsii產HEMF的影響。選取單個添加中產量較高的丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)和賴氨酸(Lys)為氨基酸源，對其進行組合，在發酵140 h時對其菌體濃度和HEMF含量進行測定，結果如表3所示。

表3 氨基酸組合添加對C.etchellsii產HEMF影響結果

由表3中的數據分析可知，氨基酸組合對C.etchellsii產HEMF有不同的影響，其中 Ala+Arg+Gly組合中HEMF產量和對菌體的產物得率最高，分別為101.74 mg/L和8.76 mg/g。而Ala+Arg+Gly+Lys組合中的HEMF產量和對菌體的產物得率也較高，分別為101.41 mg/L和8.65 mg/g，與Ala+Arg+Gly組合中差別不大，由于考慮到實際操作的可行性和簡便性，因此可以確定Ala+Arg+Gly組合可以更好地促進C.etchellsii產HEMF。

2.4 NaCl分階段調控結合氨基酸添加對C.etchellsii生產HEMF影響

為了進一步強化 HEMF的發酵生產強度，將NaCl分階段調控與氨基酸添加結合應用。選擇200 g/L NaCl為條件，根據2.2中的研究結果分別在40 h和60 h補加NaCl至220 g/L。氨基酸源選用Ala+Arg+Gly組合，在發酵140 h時對其菌體濃度和HEMF含量進行測定，結果如表4所示。

表4 兩階段NaCl添加策略和氨基酸組合添加策略結合對C.etchellsii產HEMF影響結果

由表4中的結果分析可知，兩階段NaCl添加策略和氨基酸組合添加策略結合對 C.etchellsii產HEMF均有不同程度的促進作用，其中在發酵40 h時添加NaCl至220 g/L，并結合Ala+Arg+Gly組合時，C.etchellsii產HEMF和對菌體的產物得率最高，分別為110.74 mg/L和9.51 mg/g。

2.5 7 L發酵罐驗證2種添加策略對C.etchellsii產HEMF影響

為了驗證兩階段NaCl添加策略和氨基酸組合添加策略相結合對C.etchellsii產HEMF影響，在7 L發酵罐上對C.etchellsii產HEMF進行驗證研究，結果如圖3所示。

圖3 兩階段NaCl添加策略和氨基酸組合添加對C.etchellsii產HEMF上罐驗證結果

由圖3中的過程曲線可知，發酵40 h時C.etchellsii生長進入穩定期，最大菌體濃度為10.91 g/L，在100 h HEMF產率最大，為121.51 mg/L，比空白(200 g/L NaCl且沒有添加氨基酸，圖3中未標明)提高了21.2倍。

3 討論

實驗以1株增香酵母菌C.etchellsii為研究對象，研究了在不同鹽度和添加不同種類氨基酸條件下，C.etchellsii菌體生長和產物HEMF合成的情況。

由結果分析可知，發酵體系中添加200 g/L和220 g/L NaCl利于 C.etchellsii合成 HEMF，當 NaCl濃度增加到240 g/L時不利于菌體的生長和產物HEMF的生成。分析原因是菌體細胞的培養環境與菌體生長密切相關，由于C.etchellsii篩選自高鹽稀態發酵醬油中，該類型醬油中的NaCl濃度為180～240 g/L，因此，經過高鹽度環境的馴化，C.etchellsii已經適應在高濃度NaCl環境中生長。但是，當NaCl濃度過高(≥240 g/L)時，超過了C.etchellsii的適應極限，此時菌體生長緩慢，菌體濃度較小。因此，采取分階段調控NaCl濃度的策略，可在保證C.etchellsii正常生長的同時獲得高產量的HEMF。而根據文獻報道［8］，高鹽度環境利于HDMF和HEMF等呋喃酮類物質的形成，根據C.etchellsii生長的高鹽度環境猜測原因可能是在適合菌體生長的環境下，高鹽度使得菌體細胞膜的通透性結構有所改變，對底物的利用具有更高的選擇性，使得其代謝向利于HEMF生成的方向進行。氨基酸作為C.etchellsii代謝產HEMF的前體物質，在HEMF的產生過程中起重要作用，因此選擇不同種類和不同類別的氨基酸組合對于HEMF的生成是很重要的，通過研究結果可知，選擇Ala+Arg+Gly組合更利于HEMF的生成，這可能是C.etchellsii菌體內源性形成這3種氨基酸的效率較低，需外援補充以滿足HEMF合成的需要。當三者以合適的比例組合添加到發酵體系中時，對C.etchellsii菌體內HEMF的合成產生了協同促進效應，從而提高了HEMF的產量。

［1］ Blank I，Fay L B.Formation of 4-hydroxy-2，5-dimethyl-3(2H)-furanone and 4-hydroxy-2(or 5)-ethyl-5(or 2)-methyl-3(2H)-furanone through Maillard reaction based on pentose sugars［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44(2):531－536.

［2］ Li X，Hiramoto K，Yoshida M，et al.Identification of 2，5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone(DMHF)and 4-hydroxy-2(or 5)-ethyl-5(or 2)-methyl-3(2H)-furanone(HEMF)with DNA breaking activity in soy sauce［J］．Food and Chemical Toxicology，1998，36(4):305－314.

［3］ Ohata M，Kohama K，Morimitsu Y，et al.The formation mechanism by yeast of 4-hydroxy-2(or 5)-ethyl-5(or 2)-methyl-3(2H)-furanone in miso［J］．Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2007，71(2):407－413.

［4］ Sasaki M，Nunomura N，Matsudo T.Biosynthesis of 4-hydroxy-2(or 5)-ethyl-5(or 2)-methyl-3(2H)-furanone by yeasts［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，1991，39(5):934－938.

［5］ Cao X H，Hou L H，Lu M F，et al.Improvement of soysauce flavour by genome shuffling in Candida versatilis to improve salt stress resistance［J］．International Journal of Food Science and Technology，2010，45(1):17－22.

［6］ Hauck T，Landmann C，Bruhlmann F，et al.Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3［2H］-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51(5):1 410 －1 414.

［7］ 張精安.2，5-二甲基-4-羥基-3(2H)呋喃酮的合成研究［J］．精細化工，2001，18(1):31－33.

［8］ 張海林，范文來，徐巖.高產2，5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮(DMHF)酵母菌株的選育［J］．中國釀造，2009(11):20－23.

［9］ Sugawara E，Sakurai Y.Effect of media constituents on the formation by halophilic yeast of the 2(or 5)-ethyl-5(or 2)-methyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone aroma component specific to miso［J］．Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1999，63:749－752.

［10］ He L，Xu Y Q，Zhang X H.Medium factor optimization and fermentation kinetics for phenazine-1-carboxylic acid production by Pseudomonas sp.M18G［J］．Biotechnology and Bioengineering，2008，100(2):250－259.