大豆蛋白水解物促酸奶乳酸菌增殖及生長動力學*

白鳳翎，張柏林，趙宏飛

1(渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州，121013)2(北京林業大學生物科學與技術學院，北京，100083)

酸奶是由保加利亞乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)混合發酵牛奶形成的發酵乳制品，目前用于酸奶生產的發酵劑主要為直投式發酵劑(Directed Vat Set，DVS)，其中乳酸菌的細胞數量是決定發酵劑性能的關鍵因素。由于乳酸菌缺乏一些生物代謝途徑，不能合成生長必需的氨基酸、維生素等物質，營養要求十分苛刻。同時，乳酸菌具有很弱的蛋白分解能力，必需依賴生長環境提供必需氨基酸、維生素等生長因子才能獲得高密度細胞培養。本研究根據van Niel等［1］關于乳酸菌的營養需要，并參考Zhang等的研究結果［2］，設計嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌生長的化學限定培養基(Chemically Defined Media，CDM)，以小于5 ku分子量的大豆蛋白水解物(soy protein hydrolysates，SPH)作為氮源生長添加物促進乳酸菌細胞增殖，從生長動力學、產酸能力等分析SPH中多肽、氨基酸對乳酸菌生長的促進作用機制，為生產高密度乳酸菌直投式發酵劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)S1菌株，德式乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)L2菌株，北京林業大學食品發酵實驗室保存菌種。冷凍干燥的供試菌株首先接種11%的脫脂乳培養基，在MRS瓊脂上劃線分離，37℃培養24～48 h。每次試驗取單菌落經MRS液體培養基中活化3次，以充分恢復菌株活力。

1.2 大豆蛋白水解物制備

大豆蛋白水解物以大豆分離蛋白為基質，按5%底物濃度90℃水浴中預熱15 min，冷卻，調節pH值至pH 8.0。按4 000 U/g加入堿性蛋白酶，50℃水浴作用6 h。在反應過程中，滴加2.0 mol/L NaOH維持pH值穩定。反應結束后在85℃下加熱10 min鈍化酶，離心取上清液。經Millipore Labscale TFF System Kit超濾獲得小于5 ku分子質量的大豆蛋白水解物，經測定其中多肽和氨基酸含量為3.02 g/100 mL。

1.3 培養基

1.3.1 保加利亞乳桿菌培養基

1.3.1.1 基本培養基

保加利亞乳桿菌的基本培養基配方見表1。配制過程中，維生素和無機鹽用0.22 μm濾膜過濾除菌，其余溶解后115℃ 20 min滅菌。臨用時按比例混合。

1.3.1.2 復合氨基酸培養基

用20種氨基酸代替表1中的8種氨基酸，其中每升培養基中加入半胱氨酸0.4 g，天門冬氨酸0.3 g，谷氨酸0.3 g，另外16種氨基酸各加0.2 g，氨基酸添加總量為4.2 g/L。其余成分和配制方法與基本培養基相同。

1.3.1.3 蛋白水解物培養基

表1 保加利亞乳桿菌生長基本培養基組成

用大豆蛋白水解液代替基本培養基中的8種氨基酸，添加量為5.0 mL/100mL，多肽和氨基酸添加總量為1.51 g/L。其余成分和配制方法同基本培養基。

1.3.2 嗜熱鏈球菌培養基

1.3.2.1 基本培養基

嗜熱鏈球菌的基本培養基配方見表2。

表2 嗜熱鏈球菌生長的基本培養基組成

配制時，維生素和無機鹽用0.22 μm濾膜過濾除菌，其余溶解后115℃ 20 min滅菌。臨用時按比例混合。

1.3.2.2 復合氨基酸培養基

用20種氨基酸代替基本培養基中的7種氨基酸，其中培養基中加入半胱氨酸0.4 g/L，天門冬氨酸0.3 g/L，谷氨酸0.3 g/L，另外16種氨基酸按0.2 g/L添加，氨基酸添加總量為4.2 g/L。其余成分與配制方法同基本培養基。

1.3.2.3 蛋白水解物培養基

配制方法同1.3.1.3。

1.4 方法

1.4.1 乳酸菌化學限定培養基生長分析

將活化3代的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌MRS 12 h培養物3 000 r/min離心10 min，去上清液，沉淀細胞洗2次后，調整細胞濃度為106～107個/mL。以2%接種量分別接種保加利亞乳桿菌基本培養基、復合氨基酸培養基和蛋白水解物培養基，充分搖勻。無菌條件下分裝于滅菌的試管中，每管5.0 mL，置37℃培養。從0 h開始每隔2 h以3種空白培養基調零，在600 nm處測定OD值，同時測定pH值。

按μ=(X2-X1)/T，計算生長速率

式中:μ為生長速率;X2和X1分別為T時間的OD值。

1.4.2 乳酸菌在蛋白水解物培養基與MRS培養基中的生長比較分析

將活化3代保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌MRS 12 h培養物離心去上清液，細胞洗2次后，調整細胞濃度為106～107個/mL。以2%接種量分別接種MRS培養基和蛋白水解物培養基，充分搖勻。無菌條件下分裝于滅菌的試管中，每管5.0 mL，37℃培養。從0h開始每隔4h按文獻［5］進行乳酸菌計數。

1.4.3 實驗數據處理

實驗數據采用Microsoft Office Excel 2003處理。

2 結果與討論

2.1 保加利亞乳桿菌L2生長曲線

2.1.1 L2在基本培養基中的生長曲線

保加利亞乳桿菌在含有8種氨基酸的基本培養基中的生長結果見圖1，細菌密度的OD值始終維持在一個很低的水平，總體看來細菌在該培養基中生長情況很差。0～4 h有一個上升階段，然后維持一個水平線上，最后迅速下降。pH值的變化與OD值同步，雖有一個下降過程，但幅度很小，一直維持在pH 6.2以上，說明該菌的產酸能力很有限。

圖1 L2在基本氨基酸培養基中的生長曲線

2.1.2 L2在20種氨基酸培養基中的生長曲線

在含有20種氨基酸CDM上，保加利亞乳桿菌生長過程如圖2所示。與基本培養基相比，細胞生長量可增加3倍，最大生長速率μmax在0.02/h左右。pH值從初始的pH 6.41下降到pH 4.92，從細胞密度和產酸量來看，雖然含有全價氨基酸，但細菌生長狀況不是很好，表明氨基酸并不是保加利亞乳桿菌生長最佳氮源。

圖2 L2在20種氨基酸培養基中的生長曲線

2.1.3 L2在SPH培養基中的生長曲線

L2在含有SPH培養基上生長狀況如圖3所示，生長量比20種氨基酸有很大改善，可達到1.425，分別是8種和20種氨基酸培養基的13.4倍和4.1倍。pH值下降到pH 3.94，產酸水平基本可與乳培養基相近。最大生長速率μmax為0.10/h，是20種氨基酸的5倍。

2.1.4 保加利亞乳桿菌3種培養基生長曲線比較

圖3 L2在SPH培養基中的生長曲線

保加利亞乳桿菌在3種培養基中的生長狀況結果見圖4和圖5，基本培養基生長量和產酸量維持一個很低的水平，說明8種氨基酸作為氮源能夠提供細菌的最低生長要求。20種氨基酸為細菌生長提供比較豐富的氮源，使保加利亞乳桿菌生長提高3倍。產酸量也有大幅度提高，pH值下降到pH 5.0以下。

圖4 保加利亞乳桿菌在3種培養基中的生長曲線

圖5 保加利亞乳桿菌在3種培養基的pH值變化

與MRS和脫脂乳培養基相比還相差很多，說明全價氨基酸并不能為保加利亞乳桿菌菌株獲得最適生長氮源。用分子量小于5 ku的SPH替代氨基酸作為氮源使保加利亞乳桿菌的生長狀況大為改觀，最大生長速率是20種氨基酸的5倍，pH值可下降到pH4.0以下。由此說明大豆蛋白水解物是保加利亞乳桿菌生長的最佳氮源，可獲得相對較大的生長量。

2.2 嗜熱鏈球菌S1生長曲線

2.2.1 S1基本培養基中的生長曲線

嗜熱鏈球菌在基本氨基酸培養基中的生長結果如圖6所示，S1在該培養基中生長的狀況很差，最大吸光值和最大生長速率僅為0.046/h和0.0028/h。培養基的pH值經過20 h從pH 6.30下降到pH 6.18，表明含7種氨基酸的基本培養基僅能維持細菌的最低生長水平。

圖6 嗜熱鏈球菌在基本氨基酸培養基中的生長曲線

圖7 嗜熱鏈球菌在20種氨基酸培養基中的生長曲線

圖8 嗜熱鏈球菌在SPH培養基中的生長曲線

2.2.2 S1在20種氨基酸培養基中的生長曲線

在20種氨基酸培養基上嗜熱鏈球菌的生長狀況和7種氨基酸相比有很大增長，結果見圖7。最大OD值和最大生長速率分別為0.277/h和0.024/h。在生長過程中，乳酸菌的產酸量也大幅增加，pH值從起初的pH 6.29下降到pH 4.45。

2.2.3 嗜熱鏈球菌在SPH培養基中的生長曲線

圖8是嗜熱鏈球菌在添加SPH的培養基中的生長狀況，與20種全價氨基酸培養基相比細胞生長量大幅度提高，在穩定期時OD值最高達到1.434，為20種氨基酸培養基的5倍多。最大生長速率達到0.12/h，也為20種氨基酸培養基的5倍。

2.2.4 嗜熱鏈球菌在3種培養基中的生長狀況比較

圖9和圖10分別是嗜熱鏈球菌在3種培養基中生長的細胞量和pH值變化圖，可以看出，嗜熱鏈球菌在基本培養基上細胞量只維持最低生長水平，20種氨基酸培養基雖能夠為細菌生長提供全價的氨基酸，但是生長狀況遠不如添加SPH的培養基。

圖9 嗜熱鏈球菌在3種培養基生長量的比較

圖10 嗜熱鏈球菌在3種培養基中的pH值的比較

由圖10可知，pH值與生長量變化之間存在同步關系。在基本培養基上生長水平很低，所反映的pH值變化是一條水平直線。在全價氨基酸培養基上，pH值呈現出一個緩慢的下降通道，說明隨著細菌生長有個逐漸形成乳酸的過程。在SPH培養基上，pH值變化是由一個迅速的下降階段和一個平緩的延伸階段組成，說明乳酸形成過程首先是一個與對數生長期相對應的快速產酸期，然后當細菌生長進入穩定期后產酸趨于平緩。

2.3 乳酸菌在MRS培養基的生長狀況

圖11和圖12是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在MRS培養基中的生長曲線和pH值變化關系圖。從生長量來看，兩種細菌的最大生長速率分別可達到0.215/h和0.262/h，與圖3和圖8中二菌在SPH培養基的最大生長速率0.10/h和0.12/h相比，兩者存在倍增關系，表明MRS更適合乳酸菌生長。

圖11 保加利亞乳桿菌在MRS培養基中的生長曲線

圖12 嗜熱鏈球菌在MRS培養基中的生長曲線

從pH值的變化情況來看，保加利亞乳桿菌從2 h開始時迅速下降，到達14 h后呈現一個平緩下降過程，最終穩定在pH 3.6左右。嗜熱鏈球菌產酸相對于保加利亞乳桿菌雖然下降也較迅速，但到達10 h后仍有一個緩慢的下降過程，最終定位在pH 3.8左右。二者相比保加利亞乳桿菌產酸能力較強一些。

圖13 S1在3種培養基中的細胞生長數量

圖14 L2在3種培養基中的細胞生長數量

圖13和圖14分別是嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌在全價氨基酸培養基、SPH培養基和MRS培養基中細菌細胞數量結果比較圖，在MRS培養基中兩種乳酸菌的細胞數量可達1010CFU/mL以上，SPH培養基的乳酸菌數量在109～1010CFU/mL，且接近1010數量級，20種全價氨基酸培養基的細胞數量在108CFU/mL以下。

2.4 乳酸菌生長對氮源的需要

從L2和S1在基本氨基酸、全價氨基酸和SPH 3種培養基中的生長狀況來看，基本氨基酸包括谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸和精氨酸等是乳酸菌生長的必需氨基酸［2］，只滿足乳酸菌生長氮源的最低要求。對于部分乳酸菌，同時添加天冬酰胺和谷氨酰胺后生長達到基本要求［4］。20種全價氨基酸與富含有分子量低于5ku短肽和游離氨基酸的大豆蛋白水解物相比，雖然添加大豆蛋白水解物的量只是20種氨基酸的1/3，但其最大生長速率是全價氨基酸的5倍，說明蛋白水解物中富含有更易被乳酸菌生長利用的最佳氮源。

2.4.1 乳酸菌的氮源轉運系統

乳酸菌的氮源轉運系統主要包括3種體系，一是以游離氨基酸的方式進入細胞，二是通過二肽或三肽轉運系統，三是依靠寡肽轉運系統。轉運系統一是依靠質子動力二肽載體，另一是依靠能量轉運系統，后者主要轉運4～6個氨基酸的寡肽，系統極大可能由ATP驅動或與富含能量的磷酸鹽中間底物有關［5］。通過恒化培養生長細胞內部的氨基酸池分析顯示，芳香族氨基酸主要以高稀釋比率通過被動擴散的方式進入細胞［6］。在乳中，乳酸菌利用蛋白酶水解乳蛋白形成多肽生長，多肽被吸收后被水解成氨基酸釋放到培養基中供細菌內生長需要，生長依賴寡肽作為氮源占98%，其寡肽轉運系統在利用肽方面起到至關重要的作用［7］。2種乳酸菌在3種培養基中的狀況說明，乳酸菌在SPH培養基中比在全價氨基酸培養基中獲得更好的生長，與其乳酸菌氮源轉運系統密切相關。

2.4.2 化學限定培養基與MRS培養基的比較

雖然富含有5 ku多肽和氨基酸的SPH能夠使乳酸菌獲得很好生長，但乳酸菌生長比MRS培養基低0.5～1個數量級，培養基的綜合效能不及半合成培養基MRS，這可能是由于在MRS培養基中的蛋白胨、牛肉膏和酵母膏中的組成成分如蛋白質、多肽、氨基酸和維生素等對滿足乳酸菌生長更全面、有效。然而從生長曲線的走勢來看，乳酸菌在SPH培養基中的細胞活性維持在一水平線上，MRS和全價氨基酸培養在進入穩定期后細胞數量呈下降趨勢，這也許是蛋白水解物中形成對細菌有毒副作用的產物相對少的緣故［8］。

3 結論

利用化學限定培養基對酸奶乳酸菌進行增殖作用研究，結果表明必需氨基酸只能滿足乳酸菌生長的基本氮源需要，20種全價氨基酸雖然可使保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的最大生長速率顯著提高，產酸能力明顯增強，但遠不及大豆蛋白水解物的增殖效果。用分子質量小于5ku的SPH代替全價氨基酸可使乳酸菌細胞密度增加4倍，最大生長速率增加1倍。因此說明能夠使乳酸菌迅速增殖的最佳氮源是蛋白水解物中的寡肽，而不是氨基酸，大豆蛋白水解物可以用作乳酸菌高密度培養添加物。

乳酸菌作為一特殊的細菌類群在食品發酵、保健醫療等領域具有非常重要的作用，由于乳酸菌的代謝特征，一直限制乳酸菌的高密度細胞培養技術。本研究通過化學限定培養基應用大豆蛋白水解物對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進行增殖作用研究，結果表明含有寡肽和氨基酸的大豆蛋白水解物對乳酸菌的生長具有明顯的促進作用，可以用來作為乳酸菌高密度細胞培養體系的生長促進劑。

［1］ van Niel E W J，Hahn-H?gerdal B.Nutrient requirements of lactococci in defined growth media ［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，1999，52(5):617-627.

［2］ Zhang G，Mills D A，Block DE.Development of chemically defined media supporting high-cell-density growth of lactococci，enterococci，and streptococci［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75(4):1 080-1 087.

［3］ Radke-Mitchell L，Sadine W E.Associative growth and diferential enumeration of Strptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus:a review［J］.Journal of Food Protection，1984，47:245-248.

［4］ Jensen P R，Hammer K.Minimal requirements for exponential growth of Lactococcus lactis［J］.Applied and Environmental Microbiology，1993，59(12):4 363-4 366.

［5］ Kunji E R S，Smid E J，Plapp R，et al.Di-tripeptides and oligopeptides are taken up via distinct transport mechanisms in Lactococcus lactis ［J］.Journal Bacteriology，1993，175(7):2 052-2 059.

［6］ Poolman B，Konings W N.Relation of growth of Streptococcus lactis and Streptococcus cremoris to amino acid transport.［J］.Journal of Bacteriology，1988，170(2):700-707.

［7］ Juillard V，Laan H，Kunji E R S，et al.The extracellular PI-type proteinase of Lactococcus lactis hydrolyzes beta-casein into more than one hundred different oligopeptides［J］.Journal Bacteriology，1995，177(12):3 472-3 478.

［8］ Kunji E R S，Jeronimus-Stratingh C M，Bruins AP，et al.Reconstruction of the proteolytic pathway for use of β-casein by Lactococcus lactis ［J］.Molecular Microbiology，1998，27:1 107-1 118.