糖蜜原料培養高核酸酵母NY－1培養條件優化

王媛媛，曹春紅，楊旭，肖冬光

(天津科技大學生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津，300457)

核苷酸類物質及其衍生物是遺傳工程、醫藥、食品、農業生產和科研領域十分重要的生化試劑和原料［1］，核苷酸幾乎在所有的細胞結構、代謝、能量和調節功能等方面起著重要作用［2］。Uauy表明［3］將核苷酸添加到以牛奶為基礎的代乳品中，對嬰幼兒的胃腸道發育、胃腸道健康的維持以及血漿脂蛋白的組成都有有利的影響，Brunser［4］研究結果表明外源核苷酸能減少嬰兒腹瀉的發生。從全球來看，核苷酸供不應求，是很有發展潛力的項目。

核酸酵母是工業上制取核酸的常用材料［5－6］，目前核酸酵母的培養多數采用以糖蜜為碳源的培養基，糖蜜內除了含有大量可發酵糖(主要是蔗糖)外，還含有豐富的礦物質與維生素，是培養酵母較好的碳源。工業生產中核酸酵母菌體培養濃度偏低，大多在10g/L左右，主要原因是核酸酵母只有在對數期收獲才可得到較高核酸含量，延長培養時間提高細胞濃度，往往不能保證在對數生長期收獲菌體，致使菌體細胞內的核酸含量下降。本研究通過對糖蜜原料處理工藝及對核酸酵母的培養條件進行優化，旨在延長酵母生長的對數期，在保證高核酸含量的同時，提高酵母細胞濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

高核酸酵母NY-1(High nuclear Saccharomyces NY-1)天津科技大學微生物菌種中心保藏。

1.1.2 實驗材料

工業糖蜜;尿素，NaCl、ZnSO4、FeSO4、MgSO4、KH2PO4，等均為化學純試劑;瓊脂、酵母浸粉為生化試劑。

1.1.3 實驗儀器

UV757型紫外光柵分光光度計、752N可見分光光度計，上海精科上海分析儀器廠;GHP-9050生化培養箱，上海精密儀器廠;HH-2數顯溫控水浴鍋，蘇州學森儀器設備有限公司;TDZ5-WS高速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.1.4 液體發酵培養基

總糖 40 g/L，MgSO41.2 g/L，尿素 1.2 g/L，(NH4)2SO40.3 g/L，ZnSO40.15 g/L，無水 FeSO40.15 g/L，NaCl0.1 g/L，H3PO41.8 mL，用氨水調節至pH 5.0。

1.2 方法

1.2.1 酵母泥RNA含量測定［7］

吸取4 mL發酵液于4 000r/min、10 min離心，棄上清液，稱菌體濕重;用生理鹽水洗滌菌體2次，再加入2 mL生理鹽水振蕩均勻，再加入2 mL 10%的高氯酸溶液，搖勻，于70℃水浴鍋保溫20 min(每5 min振搖1次);再于10 000 r/min、5 min條件下離心。將上清液稀釋50倍后于紫外分光光度計260 nm處測光密度OD值，計算干菌內含RNA的質量分數(%)。

空氣開關屬于一種電器元件，其存在優勢的同時也存在著一定的缺點，也并不是在任何條件下都能將其自身的優勢發揮出來。筆者在多年的實踐工作中發現使用空氣開關保護變壓器時，如果變壓器的輸出端出現短路的現象，空氣開關將不能起到保護的作用。因此為了能夠將此類問題解決，應從空氣開關的自身工作原理與變壓器的工作參數和結構角度出發，分析其不能對變壓器起到保護作用的因素。[1]

1.2.2 發酵液菌體干重的測定

取定量發酵液離心洗滌2次，將濕菌體于105℃烘干箱內烘干至恒重。

1.2.3 殘余還原糖測定方法

取發酵液樣品，離心，將上清液用斐林滴定法測定。

1.2.4 總糖的測定方法［8］

用4 mol/L的鹽酸將待測樣品在68℃水浴下進行水解，待溫度達到68℃開始計時10 min，間斷搖勻，冷卻后，用NaOH溶液中和至中性并定容至100mL，然后用斐林滴定法測定。

1.2.5 糖蜜原料的處理工藝優化

1.2.5.1 糖蜜初始處理條件［9］

1.2.5.2 糖蜜優化處理條件

方案1:用濃H2SO4調節至pH 3.8，在電爐上煮沸1 h。

方案2:用濃H2SO4調節至pH 4.0，在電爐上煮沸1 h。

方案3:用濃H2SO4調節至pH 4.0，在電爐上煮沸1.5 h。

冷卻后將3個樣品進行離心，取上清分別進行還原糖及總糖測定。

2 結果分析

2.1 氮源優化

在以糖蜜為碳源的液體發酵培養基中，添加5種不同的氮源，(NH4)2SO4、尿素、酵母粉3種單一氮源及(NH4)2SO4與酵母粉、尿素與酵母粉2種復合氮源分別進行發酵培養，選出最適合酵母生長的氮源。

2.1.1 氮源種類的選擇

氮源總添加量與1.1.4中氮源的添加量相同，其中，酵母粉以含氮量12%，菌體利用率50%計算。

圖1 氮源種類選擇實驗結果

由圖1知，添加了酵母粉的實驗組在菌體干重、發酵液中RNA含量及RNA理論產量上都明顯優于其他實驗組，但是由于酵母粉的價格較高，因此應選擇酵母粉和尿素的復合氮源培養該菌，并在此基礎上優化酵母粉和尿素的添加比例，以在提高酵母產量的同時盡可能減少酵母粉用量，從而降低生產成本。

2.1.2 復合氮源比例的選擇

圖2 復合氮源最適添加量的優化選擇

總氮源添加量相同的前提下，將酵母粉與尿素以不同比例混合添加，接種高核酸酵母菌株進行液態發酵，結果見圖2。由圖2可以看出，隨著酵母粉添加量的增加，菌體的干重和RNA含量都有所提高，但提高幅度都不是很明顯，從節約成本考慮，采用酵母粉添加量為2 g/L，尿素添加量為2.5 g/L。

2.2 培養基初始pH值優化

圖3 培養基初始pH值優化結果

由圖3可以看出初始pH 5.0的實驗組，其RNA理論產量最高，菌體干重也相對較高，因此選取培養基的初始pH值為pH5.0。

2.3 投糖濃度對NY-1生長的影響

圖4所示為3種糖濃度下酵母的生長曲線，從圖4可以看出，該菌在3種投糖濃度下生長時均在6h進入減速生長期，且菌體生物量沒有顯著差別，糖濃度為40、50和60g/L時，菌體濃度分別為8.72、8.34和8.66g/L。投糖濃度越高，酵母對糖的利用率就越低，說明培養基中的糖未得到有效利用。

圖4 三種投糖濃度下菌體的生長曲線

糖濃度為60 g/L時發酵過程中發酵液總糖和還原糖的變化情況見表1。從表1看，發酵至6 h時，發酵液中還原糖的含量降至6.95 g/L，糖濃度較低可能是酵母進入減數生長期的原因之一。另一方面，發酵至6 h時的總糖濃度為25.1 g/L，糖蜜中的蔗糖基本上沒有水解，這說明該菌體的蔗糖酶活性偏低，對蔗糖的利用速率較慢。因此要延長菌體生長的對數期，應先從糖蜜的預處理方法上著手，即提高糖蜜處理完后總糖的水解率。

表1 投糖60 g/L時發酵過程中發酵液總糖和還原糖的變化情況

2.4 糖蜜處理工藝優化

2.4.1 不同糖蜜處理方法下總糖的水解情況

表2為不同糖蜜處理工藝下總糖的水解情況，由表2知，加熱時間相同，酸度越低，蔗糖水解率越高;酸度相同，加熱時間越長，蔗糖水解率越高。本實驗中總糖水解率最高的糖蜜處理條件為方案3，即用H2SO4調節至pH4.0，煮沸1.5 h，此時總糖的水解率可達到75%。

表2 不同糖蜜處理方法下總糖水解情況

2.4.2 提高糖蜜水解率前后菌體培養結果

圖5為提高糖蜜水解率后菌體的生長曲線，從圖5看，提高糖蜜水解率后，相同投糖濃度(60 g/L)，菌體生長的對數期被延長大約3 h，菌體濃度提高約25%。表3為提高糖蜜水解率后發酵過程中總糖與還原糖的情況，從表3看，發酵至6 h時還原糖含量為12.4 g/L，明顯高于提高水解率前的糖濃度;發酵至9 h時，發酵液中還原糖含量下降至6.5 g/L，與未處理糖蜜時發酵6 h時還原糖濃度相當，酵母進入減速生長期，說明提高糖蜜中總糖的水解率后可以延長酵母對數生長期，提高糖的利用率。

圖5 提高糖蜜中蔗糖水解率前、后核酸酵母的生長曲線

表3 提高糖蜜總糖水解率后發酵液總糖和還原糖的變化情況

表4為提高糖蜜總糖水解率前后培養核酸酵母的結果，由表4可知，提高糖蜜總糖水解率后，菌體RNA含量提高了16.5%，但菌體濃度基本不變，酵母對糖的得率仍然較低。

表4 提高糖蜜總糖水解率前后60 g/L投糖時菌體生長情況對比表

2.5 溶氧對菌體生長的影響

表5為溶氧對菌體生長的影響，由表5可以看出，在普通的三角瓶內，減少裝液量可以提高菌體的生物量，用擋板瓶代替普通的三角瓶提高溶氧效果，可明顯提高菌體的生物量，可見提高溶氧有利于菌體生物量的增加。

表5 溶氧對菌體生長的影響

3 結論

實驗證明，核酸酵母在生長過程中對溶氧的需求較高，其內的蔗糖酶活性較低，因此，在工業生產中要著重完善供氧設備，同時采用較高的糖蜜水解率。另外，可從菌種出發，篩選出蔗糖酶活性高的核酸酵母，這樣在工業生產過程中可大大減少糖蜜原料處理過程中的用酸量，有利于進一步降低生產成本。

［1］ 婁永江，吳漢民，王海洪.從桔青霉M71生產核酸酶P1及酶活提高途徑［J］．寧波大學報，1997，10(3):21－28.

［2］ 汪余勤，程五鳳，李宣海.核苷酸與營養［J］．國外醫學衛生學分冊，1999，26(5):257 －260.

［3］ Uauy R，Quan R.Role of nucleotides in intestinal development and repair:implications for infant nutrtion［J］．J Nutr，1994，124:1 436 －1 441.

［4］ Brunser D，Espinoza J.Effect of dietary nucleotide supplimentation on diarrhoeal disease disease in infants［J］．Acta Paedia，1994，83(2):188 － 191.

［5］ 宋思揚，樓士林．生物技術概論［M］．北京:科學教育出版社，1999:80－120．

［6］ 桂建芳．RNA加工與細胞周期調控［M］．北京:科學出版社，1998:20－128．

［7］ 盛建國，李靈敏.K-79高核酵母發酵廢糖蜜制備核糖核酸的研究［J］．食品工業科技，2007，28(1):140－142.

［8］ 于景芝，陳堯燊，俞學鋒.酵母生產與應用手冊［M］．北京:中國輕工業出版社，2005.

［9］ 肖冬光，丁勻成，鄒海晏.釀酒活性干酵母的生產與應用技術［M］．呼和浩特:內蒙古人民出版社，1994.