玉米原料超高濃度酒精發酵

許宏賢，段鋼

(杰能科(中國)生物工程有限公司亞太谷物加工酶應用中心，江蘇無錫，214028)

由于石油危機而造成的國家能源安全、農民收入和環境等問題而使得生物酒精的生產日益受到重視，近幾年發展較快，中國已成為世界上第三大生物酒精生產國。現在工業上的生物酒精絕大部分屬第一代燃料乙醇，即用淀粉質原料來生產［1］。據釀酒協會酒精分會的統計，2004年我國酒精生產玉米原料占50.3%，經過近幾年的發展，玉米現在已經占到65%［2］。適度發展玉米燃料乙醇有益于糧食供需平衡，依然可以起到玉米供需平衡蓄水池的作用。同時玉米也是深加工鏈條最長、產品系列最豐富的糧食品種［3］，因此相對于其他淀粉質原料，玉米酒精發酵的研究意義更大。

高濃度酒精發酵工藝具有高發酵率、高轉化率、低殘糖和節約能源等特點，可大幅度增加產量，顯著提高經濟效益［3－4］。據哈爾濱中國釀酒有限公司的生產實踐表明，按年產6萬t酒精計算，實施濃醪發酵后年節約一次水12萬t，噸酒精節電62.5°，噸酒精節約煤160 kg，年節約資金675萬元，減排廢水15萬t［5］。因此，酒精濃醪發酵是發酵酒精工藝的重大技術進步，已經成為酒精行業清潔生產重點推廣的技術之一。

中國開展生料釀酒研究始于20世紀70年代。以節能、減排、高出酒率、高濃度發酵為特點的無蒸煮生料發酵工藝是燃料乙醇生產技術的未來發展方向［1］。近期的研究增多［6－12］，商業化過程進展也加快［10］。但相對而言，生料超高濃度酒精發酵的研究并不多［11－12］。

若采取傳統的蒸煮工藝進行超高濃度酒精發酵，由于黏度問題，在配料濃度很高的情況下，會造成液化非常不徹底，并且濃醪的換熱和輸送在工廠會變得異常困難，同時也影響發酵體系的傳質，而使過程效率降低［7－8］;即便不考慮黏度問題，在這種條件下往往需要特別的耐高糖度、耐高酒度的酵母［13－15］。

生料工藝除了可以節約能量外，由于整個系統中溫度遠遠低于淀粉的糊化溫度，沒有劇烈的反應，體系黏度比傳統過程低得多［7－8］，因此可以大幅提高發酵濃度而不必過分擔心黏度問題。同時由于生料過程中，葡萄糖是逐步緩慢釋放的，因此可以進行濃醪發酵而減輕高初糖濃度和高滲透壓對酵母的生長抑制。

相關研究表明，傳統的濃醪發酵溫度對酵母的生長和發酵效率非常重要［16－18］，采用溫度梯度培養方式進行的研究近期有所報道［12，19］，而針對玉米生料濃醪發酵過程中溫度影響的研究尚未見報道，對酵母在不同工藝中的數量和形態的研究也未見報道。本文以玉米為原料，對不同過程的黏度變化與酵母情況進行考察，同時研究不同溫度控制方式對玉米超高濃度酒精發酵的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗原料

全磨40目玉米粉，中糧肇東酒精廠試驗室提供;安琪牌釀酒高活性干酵母(耐高溫型)。

1.1.2 主要酶制劑

顆粒淀粉水解酶(STARGEN 001)，酶活力443 GAU/g;高溫淀粉酶(SPEZYME ALPHA)，酶活力15170AAU/g;糖化酶(GA-L-NEW)，酶活力100000wu/g;酸性蛋白酶(FERMGEN)，酶活力1000SAPU/g。均為杰能科國際公司產品。

1.1.3 主要試劑

無水乙醇(HPLC)，北京色譜中心;葡萄糖(HPLC)，Sigma公司;麥芽糖(HPLC)，Sigma公司;甘油(HPLC)，北京色譜中心;乳酸(HPLC)，北京色譜中心;乙酸(HPLC)，北京色譜中心;純水，Millipore制備，純水電阻18.2 MΩ。

1.2 實驗設備

高壓液相色譜，Agilent 1100系列;快速黏度儀，Perten RVA 4500;顯微鏡，OLYMPUS CX40，配DT2000真彩色圖像分析系統;Brix計，Mettler Toledo RE40D折光計;天平，Sartorius系列;移液槍，熱電(上海)儀器有限公司;酸度計，Mettler Toledo Delta 320系列;冷卻電熱恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司特制。

1.3 分析方法

1.3.1 醪液黏度測定

Perten RVA 4500快速黏度儀，程序根據試驗需求設定，醪液量28.00g。

1.3.2 酵母測定

OLYMPUS CX40顯微鏡下觀察，血球計數板計數，大小由DT2000真彩色圖像分析系統分析。

1.3.3 發酵醪組成測定

高效液相色譜法HP1100高效液相色譜儀，HP Chemstations色譜工作站，色譜柱Bio-Rad 87H。色譜分離操作條件(常溫下進行)流動相0.01 mol/L H2SO4;流速 0.6 mL/min;柱溫 60℃;進樣量 20 μL。

1.3.4 乙醇體積分數測定

蒸餾-比重法。

2 結果與討論

2.1 不同工藝對黏度的影響

生料工藝:取一定量全磨玉米粉，全部通過40目篩(即顆粒度＜0.420 mm)，測定水分，配制成絕對干物。濃度為35%的玉米醪液，用26%H2SO4將料液pH調整至4.5，加入顆粒淀粉水解酶STARGEN 001 1.5G AU/g，編輯程序如表1所示，取28.00 g醪液進行測量，結果詳見圖1。可溶性干物用Mettler Toledo RE40D折光計測量，結果如圖2所示。

傳統工藝:取一定量全磨玉米粉，全部通過40目篩(即顆粒度＜0.420 mm)，測定水分，配制成絕對干物濃度為35%的玉米醪液，用26%H2SO4將料液pH調整至 5.6，加入高溫淀粉酶 SPEZYME ALPHA 0.04%，編輯程序如表1所示，取28.00 g醪液進行測量，結果詳見圖1。可溶性干物用Mettler Toledo RE40D折光計測量，結果如圖2所示。

表1 不同工藝黏度測定程序

圖1 玉米超高濃度醪液傳統工藝與生料工藝粘度對比

如圖1所示，在醪液濃度為35% 的情況下，即便采用生料工藝，即恒定溫度32℃，由于醪液非常濃，(按玉米粉水分16%計，料水比達到1∶1.46)，醪液的黏度可達530×10－3Pa·s左右。若采取傳統工藝，由于反應劇烈，醪液的黏度在整個過程中有著巨大的變化。在50℃預熱階段傳統工藝的黏度低于生料工藝32℃的黏度;這是由于流體的黏度從結構上被認為是由于分子間的相互作用力限制分子的運動產生的。這些作用力取決于決定分子自由空間度的分子間的相互距離，同時分子間距受溫度影響顯著。在較高的溫度下，隨著分子間距的增加，分子熱運動能提高，提供分子躍遷的孔穴增多，流動阻力減小，故體系黏度下降［20］;隨著溫度進一步升高，淀粉顆粒開始迅速膨脹，當溫度升高到60～80℃，淀粉顆粒的體積可膨脹到原來的50～100倍，淀粉分子間的作用力減弱，引起淀粉顆粒的部分解體，醪液由原來的固、液兩相形成均一的黏稠液體［21］，在此糊化過程中，盡管高溫淀粉酶SPEZYME ALPHA的添加量達到0.04%，醪液黏度的峰值仍達到9.2 Pa·s以上;在90℃液化過程中，淀粉被酶分子水解，不斷變成小的葡萄糖聚合體，醪液黏度顯著降低;但在隨后的降溫過程中，流動阻力不斷加大，醪液黏度逐步上升，當醪液溫度降至32℃時，黏度值達到2.5 Pa·s以上。在酒精行業，一般認為醪液黏度超過2 Pa·s，會造成過程料液輸送困難和發酵傳質困難［21］，故對于超高濃度35%來講，糊化、液化變得非常困難，高黏度的液化液會引起一系列的問題，如輸送困難，換熱效率大大下降，發酵的傳質不好從而影響整個工廠的運轉等等。

圖2 傳統工藝與生料工藝玉米超高濃度醪液可溶性干物質對比

如圖2所示，傳統工藝的可溶性干物達到34.5Brix，生料工藝的可溶性干物僅為6.5Brix，高濃度的可溶性物質會對體系中的滲透壓、水活度、溶氧、酵母的活性等各方面產生負面影響，從而不利于發酵的進行。

2.2 不同工藝玉米高濃度酒精發酵

考慮到35%絕干濃度的料液即便是在實驗室的研究過程中傳質也已經非常困難，故采用絕干濃度為31%的料液對2種工藝進行比較。

生料工藝:取一定量全磨玉米粉，全部通過40目篩(即顆粒度＜0.420 mm)，測定水分，配制成絕對干物濃度為31%的玉米醪液，用26%H2SO4將料液pH值調整至4.5，加入顆粒淀粉水解酶STARGEN 001 0.785GAU/g，接入0.4%活化好的干酵母于32℃發酵，不同時間取樣進行色譜分析結果如表2所示;發酵結束時對酵母顯微鏡觀察，用DT2000真彩色圖像分析系統計數并統計大小，結果如圖2所示。

傳統工藝:取一定量全磨玉米粉，全部通過40目篩(即顆粒度＜0.420 mm)，測定水分，配制成絕對干物濃度為31%的玉米醪液，用26%H2SO4將料液pH調整至 5.6，加入高溫淀粉酶 SPEZYME ALPHA 0.04%，于90℃水浴中維持90 min，取出先粗調pH，滅酶，冷卻至室溫，并補水至記錄的體積以補充在此過程中蒸發的水分，調節pH至4.2，滅酶，添加新型液體糖化酶GA-L-NEW，添加量為0.1%;酸性蛋白酶，添加量0.01%;接入0.4%活化好的干酵母于32℃發酵，不同時間取樣進行色譜分析結果見表2。發酵結束時對酵母顯微鏡觀察，用DT2000真彩色圖像分析系統計數并統計大小，結果如圖3所示。

表2 傳統工藝與生料工藝HPLC對比

如表2所示，對傳統工藝來講，三糖以上的含量由24 h的1.26%降低到68 h的0.51%，表明隨著發酵的進行，糖化酶逐步把糊精/淀粉水解成葡萄糖;三糖的含量也從0.13%降低到0.06%;二糖的含量總體變化不大，發酵結束時有0.39%的殘余;葡萄糖的含量變化較大，24h高達13.59%，表明即使采取邊糖化邊發酵工藝，由于發酵前期糖化酶釋放葡萄糖的速度遠比酵母將葡萄糖轉化為酒精的速度快，會形成一定程度的葡萄糖積累，而相關研究表明，較高的糖濃度會產生底物抑制作用，使酵母生產能力降低［19］，隨著發酵的進行糖化酶釋放出的葡萄糖被酵母逐步轉化為酒精，發酵結束時殘余的葡萄糖含量為0.22%;而對生料工藝來講，整個發酵過程中三糖以上幾乎沒有變化，表明淀粉是在顆粒狀態下(完全沒有溶出)被生料顆粒酶水解的，麥芽三糖含量始終為0，二糖和葡萄糖的含量在整個發酵過程中一直維持很低水平，發酵結束時均為0，也就是說整個過程中沒有糖的累積，酵母始終處于一種饑餓并代謝旺盛的狀態，生料酶水解出來的葡萄糖完全被酵母利用;2個工藝的乳酸含量接近，乙酸含量生料工藝略低于傳統工藝，表明生料過程沒有發生染菌，并且減少了有機酸的產生;值得一提的是。甘油的產量，生料工藝遠低于熟料工藝，表明由于生料工藝不會產生可溶性干物質，體系中的滲透壓很低，生料過程中酵母細胞內的受氫體乙醛的產生比傳統工藝快且多，代謝途徑不再朝甘油方向進行，與傳統工藝相比，生料過程的副產物大幅降低，由于甘油非常好的保濕性，甘油產量的減少還意味著DDGS干燥過程的改善;生料過程的酒精產量高于傳統工藝，這意味著出酒率的提高和糧耗的降低，導致這一結果的原因分析見后。

圖3 傳統工藝與生料工藝發酵終點酵母數對比

如圖3所示，發酵結束時傳統工藝的酵母數為3.7×108/mL，生料工藝為2.5×108/mL，生料工藝的酵母數比傳統工藝少很多，表明生料過程用于合成酵母的糖耗低于傳統過程。

圖4 傳統工藝DT2000真彩色圖像分析系統統計

由圖4和圖5所示，傳統過程的酵母平均面積為21.61μm2，生料過程的酵母平均面積為13.21μm2，傳統過程有約40%的酵母平均面積大于20.0μm2，生料過程大于20.0μm2的僅為13%左右。傳統過程的酵母比生料過程大很多。相關研究表明，在傳統工藝中，液化后進行糖化的過程比邊糖化邊發酵的流加糖過程提供了更高的初糖，但營養過剩反而會造成酵母過快生長，體積較大，后期產生酒精的能力不強［22］。綜合色譜結果，在生料過程與傳統的邊糖化邊發酵過程的對比中，發現了相似的現象，傳統過程的酵母個頭大但產酒能力不如生料過程中個頭小的酵母，由此可見，在酒精生產上，在保證酵母菌能達到一定的數量后，酵母菌的個體質量更為關鍵!

圖5 生料工藝DT2000真彩色圖像分析系統統計圖

綜上所述，以下因素可能是導致生料過程的酒精產量高于傳統過程的原因:

(1)相關研究表明，玉米中的游離糖含量為1.0% ～3.0%［23］，如果采用傳統蒸煮過程，這些游離糖有相當量會與蛋白發生反應，或在高溫下發生其它變化而變為不可發酵性糖，生料過程由于避免了高溫，使這部分糖得以利用;

(2)由于生料工藝不會產生可溶性干物質，體系中的滲透壓很低，發酵過程的副產物如甘油、有機酸減少，能使更多的葡萄糖轉化成酒精;

(3)生料過程中的酵母數少于傳統過程，酵母小于傳統過程，表明用于合成酵母的葡萄糖少于傳統過程，使得更多的糖轉化成酒精。

2.3 溫度梯度控制超高濃度酒精發酵

前期相關研究表明［12］，對于超高濃度生料酒精發酵，在恒定培養溫度條件下，發酵溫度越高前期酒精的生產速率越高，但酵母衰老的也越早，酒精的產物抑制也越嚴重;低溫發酵雖然非常有利于發酵后期酒精的生產，但前期產酒較慢，發酵周期偏長。溫度梯度控制是實現高強度超高酒精發酵的重要途徑。本文將繼續探討溫度梯度控制對玉米超高濃度酒精發酵的影響。

生料溫度梯度控制工藝:取一定量全磨玉米粉，全部通過40目篩(即顆粒度＜0.420 mm)，測定水分，配制成絕對干物濃度為35%的玉米醪液，用26%H2SO4將料液pH調整至4.5，加入顆粒淀粉水解酶STARGEN 001 1.5GAU/g，接入0.4%活化好的干酵母，發酵過程中對醪液分別在32、28、25、20℃恒溫水浴鍋中進行溫度梯度控制(詳見圖6)。不同時間取樣用HPLC測定發酵醪組成，發酵結束采樣進行蒸餾測定醪液在標準條件下的酒精含量，結果如圖7所示。

圖6 生料工藝不同方式溫度梯度控制

圖6顯示了不同溫度梯度控制的方式，其中方式一為3次降溫，其余為2次降溫。

圖7 梯度降溫策略對玉米超濃醪生料酒精發酵的影響

圖7顯示了濃度為35%生料濃醪酒精發酵采取不同方式溫度梯度控制過程中葡萄糖濃度和酒精的變化。由圖7可知，采取方式一(0～27 h 32℃，27～46 h 28℃，46～49 h 25℃，49～98 h 20℃)的培養方式，葡萄糖濃度在72 h出現下降，說明整個過程降溫不夠及時，導致最終乙醇含量較低(20.06%)，且殘余葡萄糖最高(2.01%);采取方式二(0～27 h 32℃，27～46 h 25℃，49～98 h 20℃)和采取方式三(0～24 h 32℃，24～46 h 28℃，46～98 h 20℃)以及方式四(0～24 h 32℃，24～46 h 28℃，46～98 h 20℃)的培養方式，葡萄糖濃度從46 h出現下降，殘余葡萄糖分別為1.03%，1.15%，1.67%，乙醇分別為20.45%，20.53%，20.13%，若采取方式五(0～24 h 32℃，24～46 h 25℃，46～98 h 20℃)的培養方式，葡萄糖濃度在24 h達到高點后持續降低，最終乙醇達到20.79%，殘余葡萄糖僅0.46%。由此可見，溫度是超高濃度酒精發酵過程中影響菌體生長的重要因素，對于超高濃度玉米酒精生料發酵，及時合理調整發酵溫度至關重要，方式三和方式五的發酵效果較為理想。

總體來講，由于采取生料無蒸煮工藝，葡萄糖逐步緩慢釋放，淀粉未溶出，整個體系的滲透壓非常低;采取適當的溫度梯度控制策略，使酵母細胞的活力得以長久維持，增強了酵母生產乙醇的能力和對酒精的耐受性，采取生料無蒸煮工藝，使用普通市售酒用干酵母，在98 h內發酵醪液乙醇體積分數可達20%以上。

3 總結與展望

高濃發酵，節能、高效、減少投資、減少操作單元、更好的副產品是酒精工業化生產的期望，酶制劑的進步使得本來非常困難的問題在新的工藝過程中不再成為制約的瓶頸，如超高濃度發酵時的黏度問題，超高濃度發酵所需的特殊耐高酒度的酵母等等。本文通過溫度梯度控制策略，采取玉米生料無蒸煮工藝，使用普通市售酒用干酵母，在98 h內發酵醪液乙醇體積分數可達20%以上，為進一步深入研究超高濃度酒精發酵提供了新的思路。

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