云南水晶石榴果皮中多酚組分及抗氧化活性分析*

孫麗平，張會(huì)林，楊美智子，劉洋銘，莊永亮

(昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，食品工程研究中心，云南 昆明，650500)

石榴(Punica granatum)為石榴科石榴屬植物，在我國(guó)栽培廣泛。云南省蒙自、建水、巧家、呈貢等地的水晶石榴具有生長(zhǎng)海拔高、日照時(shí)間長(zhǎng)的自然優(yōu)勢(shì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高［1］。目前，云南水晶石榴除鮮銷外，主要生產(chǎn)石榴汁原漿，據(jù)悉，云南某石榴加工廠一年即可消耗石榴1.25萬t，生產(chǎn)石榴汁原漿5 000 t。石榴果皮是加工副產(chǎn)物，占石榴鮮果重的50%左右，研究發(fā)現(xiàn)其含有豐富的多酚物質(zhì)，且抗氧化活性很高，目前，學(xué)者已對(duì)河北［2］、新疆［3］、陜西［4－5］等地生產(chǎn)的石榴果皮中抗氧化物質(zhì)進(jìn)行了研究和報(bào)道，但是對(duì)云南水晶石榴的研究還很少。本文提取云南水晶石榴皮中的多酚物質(zhì)，用Folin-Ciocalteu及HPLC法測(cè)定其多酚的含量、分析多酚的組成，并測(cè)定提取物的還原能力、DPPH自由基清除能力、抑制脂質(zhì)體過氧化能力和清除亞硝酸能力等體外抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

采集云南產(chǎn)新鮮水晶石榴，收集果皮，60℃烘干，粉碎，過40目篩，備用。

甲醇，色譜級(jí);大豆卵磷脂、1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radicals(DPPH·)、沒食子酸、蘆丁、綠原酸、原兒茶酸、山萘酸、槲皮素、水楊酸、苯甲酸、香蘭素、木犀草素、咖啡酸、兒茶素、丁香酸、香豆酸、鞣花酸和阿魏酸，標(biāo)準(zhǔn)品級(jí);其他為試劑為分析純。

Agilent1200高效液相色譜儀(美國(guó) Agilent公司)，TU1901型雙光束紫外可見光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，78－1型磁力攪拌器(深圳市國(guó)華儀器廠)，LXJ-IIB型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，SB-5200DTD超聲波清洗器(寧波新芝生物有限公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多酚的微波輔助提取

準(zhǔn)確稱取一定量果皮粉，按1∶20(g:mL)料液比，加入體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇溶液，480 W輸出功率下微波處理45 s，過濾，取濾液定容至50 mL，制備多酚提取液。

1.2.2 多酚總量的測(cè)定［6］

采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定果皮中多酚含量，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品。準(zhǔn)確吸取不同濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作液和多酚提取液各1 mL于10 mL試管中，然后依次加入1 mL去離子水，0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，1.5 mL Na2CO3(7.5%)溶液，最后用水定容至10 mL，在50℃水浴下保持10 min，冷卻，在760 nm測(cè)吸光值。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為:y=0.008 6x+0.006 7，R2=0.998 6，其中 y為吸光度，x為沒食子酸含量。果皮中多酚含量表達(dá)為mg/g(干重)。

1.2.3 多酚組成的測(cè)定

將1.2.1制備的多酚提取液進(jìn)行微孔(0.45 μm)過濾，濾液進(jìn)行酚類物質(zhì)組成分析。色譜條件:Agilent1200高效液相色譜儀，配備自動(dòng)進(jìn)樣器和光電二級(jí)陣列檢測(cè)器;Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm);流動(dòng)相:A甲醇，B 0.3%磷酸溶液;梯度洗脫:0～70 min，A從0% ～100%，100%A保持10 min;流速:1.0 mL/min;柱溫:25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。不同濃度的沒食子酸、蘆丁、綠原酸、原兒茶酸、山萘酸、槲皮素、水楊酸、苯甲酸、香蘭素、木犀草素、咖啡酸、兒茶素、丁香酸、香豆酸、鞣花酸和阿魏酸建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，出峰時(shí)間定性，峰面積定量，分析提取液中多酚類物質(zhì)的組成及含量。

1.2.4 提取液抗氧化活性測(cè)定

1.2.4.1 還原能力的測(cè)定

取1 mL稀釋為一定濃度梯度的提取液，加入1 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)和1 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50℃水浴20 min，取出，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻，迅速冷卻。取1 mL混合液于5 mL離心管中，加入1mL超純水和0.2 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混勻，蒸餾水代替樣品為空白，測(cè)定溶液在700 nm處的吸光度(A700)。以A700表示樣品的還原能力，EC50值表示A700為0.500時(shí)多酚的濃度。

1.2.4.2 清除DPPH自由基能力測(cè)定

取0.4 mL稀釋為一定濃度梯度的提取液，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液，混勻，暗處放置30 min并不斷振蕩，在517 nm處測(cè)其吸光度。0.4 mL水+2 mL甲醇為空白，0.4 mL蒸餾水代替樣品為對(duì)照。清除率計(jì)算公式為:

1.2.4.3 抑制脂質(zhì)體過氧化能力的測(cè)定

取1 mL稀釋為一定濃度梯度的提取液，依次加入1.0 mL脂質(zhì)體磷酸鹽緩沖液分散系，1.0 mL 40 μm/L 三氯化鐵溶液，1.0 mL 400 μm/L L-抗壞血酸，混勻，避光37℃水浴中60 min，再加入2.0 mL三氯乙酸-硫代巴比妥酸-鹽酸混合液，沸水浴反應(yīng)15 min，立即冷卻，5 000 r/min離心10 min，取上清液在532 nm下測(cè)定吸光值。1 mL蒸餾水代替樣品+1 mL磷酸鹽緩沖溶液代替脂質(zhì)體分散體系為空白，1 mL蒸餾水代替樣品為對(duì)照，抑制率計(jì)算公式為:

1.2.4.4 亞硝酸鹽清除能力的測(cè)定

取1 mL稀釋為一定濃度梯度的提取液，加入2 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉溶液，沸水浴30 min，取出，加入1 mL0.4%對(duì)氨基苯磺酸，混勻，靜置5 min，加入0.5 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，混勻，定容至25 mL，靜置15 min后，在538 nm處測(cè)其吸光度。3 mL蒸餾水代替1 mL樣品和2 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉溶液為空白，1 mL體積分?jǐn)?shù)65%乙醇溶液代替樣品為對(duì)照，清除率計(jì)算公式為:

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少3次重復(fù)，測(cè)定結(jié)果表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，差異顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 云南水晶石榴果皮中多酚含量及其組成

云南水晶石榴果皮中的多酚含量及其組成見表1。總酚含量為99.60 mg/g(干重)，高于新疆和田產(chǎn)石榴［46.58 mg/g(干重)］［3］、陜西漢中產(chǎn)石榴［0.84 mg/g(干重)］［5］以及 Singh 等［7］和 Li等［8］報(bào)道的石榴果皮中多酚含量(4.13%和7.86%)，但低于陜西臨潼產(chǎn)石榴(23.68%)［4］。其原因既與種屬、產(chǎn)地有關(guān)，也與儲(chǔ)運(yùn)及提取方法的不同有關(guān)［9］。

表1 云南水晶石榴果皮中總酚含量、多酚組成及其含量

表1結(jié)果顯示，云南水晶石榴果皮中共檢出16種標(biāo)準(zhǔn)品的9種，其中香豆酸、兒茶素和原兒茶酸為主要成分，含量分別為4.80、3.96和1.96 mg/g(干重)。李國(guó)秀［4］在陜西產(chǎn)的石榴果皮中未檢測(cè)到兒茶素，原兒茶酸含量也極低。

2.2 云南水晶石榴果皮多酚提取物的抗氧化活性

多酚類物質(zhì)具有活潑的多羥基結(jié)構(gòu)，從而具有較強(qiáng)供電子能力，使其成為有效的抗氧化活性成分，但多酚提取物抗氧化能力的強(qiáng)弱與其多酚組成及其配比有關(guān)［10］。由圖1可以看出，云南水晶石榴果皮多酚提取物表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化活性，提取物在其還原能力EC50值時(shí)的濃度為23.00 μg/mL，在DPPH自由基清除能力、抑制脂質(zhì)體過氧化能力和清除亞硝酸能力IC50值時(shí)的濃度分別為10.10、350.00和182.00 μg/mL。

由圖1相關(guān)性分析可知，云南水晶石榴果皮多酚提取物的抗氧化活性與其濃度均在P＜0.01水平上顯著相關(guān)，還原能力、DPPH自由基清除能力、抑制脂質(zhì)體過氧化能力和清除亞硝酸能力的相關(guān)性系數(shù)(R2)在0.888 1～0.995 8。與陜西臨潼產(chǎn)石榴果皮多酚提取物的抗氧化能力相比［4］，本文中云南水晶石榴果皮多酚提取物的還原能力較強(qiáng)，但是對(duì)DPPH的清除能力和脂質(zhì)體過氧化抑制能力較弱，這可能是多酚提取物的組成不同及測(cè)定方法不一樣［10］。

圖1 云南水晶石榴果皮多酚提取物的抗氧化活性及其相關(guān)性

3 結(jié)論

(1)云南產(chǎn)水晶石榴果皮中富含多酚類物質(zhì)，其總酚含量為99.60 mg/g(干重)。HPLC法檢出提取物中有9種酚類物質(zhì)，其中香豆酸、兒茶素和原兒茶酸是主要成分，含量分別為4.80、3.96和1.96 mg/g(干重)。

(2)云南水晶石榴果皮多酚提取物表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化活性，且多酚提取物的抗氧化活性與其濃度相關(guān)性顯著(P＜0.01)，R2分別為0.995 8、0.888 1、0.983 3和0.985 6。結(jié)果表明，云南產(chǎn)水晶石榴果皮是一種很好的天然抗氧化物質(zhì)資源。

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