發(fā)酵促進(jìn)劑在三孢布拉霉生產(chǎn)番茄紅素中的應(yīng)用*

師艷秋，辛秀蘭，袁其朋

1(北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京，100029)2(北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)系，北京，100029)

番茄紅素是一種重要的脂溶性類胡蘿卜素，具有很強(qiáng)抗氧化、清除自由基、抗癌抑癌、增強(qiáng)機(jī)體免疫、延緩衰老和預(yù)防心血管疾病等重要的生理功能［1］，是一種很有發(fā)展前途的新型功能性天然色素。它的生產(chǎn)方法主要有3種:天然植物提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。天然提取法以天然植物為原料，經(jīng)有機(jī)溶劑提取或超臨界萃取制取類胡蘿卜素，但由于原料含量太低，生產(chǎn)成本居高不下［2］。化學(xué)合成法可商業(yè)生產(chǎn)β-胡蘿卜素和番茄紅素等類胡蘿卜素，雖然生產(chǎn)成本低，但產(chǎn)品吸收率較低，而且人們對化學(xué)合成品毒副作用的擔(dān)心，限制了其市場的發(fā)展［3］。微生物發(fā)酵法與天然植物提取法和化學(xué)合成法相比，具有產(chǎn)量高、成本低、產(chǎn)品無毒副作用、體內(nèi)吸收率高等優(yōu)點(diǎn)，是目前番茄紅素生產(chǎn)的主要方法［3］。毛霉目真菌三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)是世界上最常用的β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株。根據(jù)Blakeslea trispora的代謝途徑，若在發(fā)酵過程中添加合適的阻斷劑，阻斷番茄紅素到β-胡蘿卜素的代謝途徑，就可以促進(jìn)番茄紅素的積累［4］。可由Blakeslea trispora生產(chǎn)的番茄紅素已被聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)、食品添加劑委員會(huì)(JECFA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)定為A類營養(yǎng)素，并被50多個(gè)國家和地區(qū)作為具有營養(yǎng)與著色雙重作用的食品添加劑，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域［5］，在歐美保健食品市場上供不應(yīng)求。因此，用微生物發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的研究也日益受到重視。

選育構(gòu)建高產(chǎn)菌種及優(yōu)化發(fā)酵條件，是利用生物技術(shù)生產(chǎn)類胡蘿卜素不可缺少的兩個(gè)方面(內(nèi)外因關(guān)系)。研究和實(shí)踐表明，在已確定碳源、氮源及其用量等的基本培養(yǎng)基中，添加某些發(fā)酵促進(jìn)劑對于促進(jìn)發(fā)酵和增產(chǎn)往往具有事半功倍的效果［6］。

為此，筆者結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)的提高番茄紅素發(fā)酵水平及其發(fā)酵機(jī)理研究課題所作的部分工作，結(jié)合國內(nèi)外發(fā)酵促進(jìn)劑作用于番茄紅素生產(chǎn)的研究現(xiàn)狀，對三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素中添加的各種促進(jìn)劑及對番茄紅素生產(chǎn)的影響進(jìn)行了綜述，并依據(jù)作用機(jī)制的不同，進(jìn)行了系統(tǒng)地歸類總結(jié)。

1 性激素——三孢酸以及結(jié)構(gòu)類似物

三孢酸是Blakelea Trispora(+)和(-)菌混合培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，為Blakelea trispora、Phycomyces blakesleanus和Mucedo等毛曲霉目的性激素，對提高類胡卜素的合成能力有重要的作用。究其原因就是混合培養(yǎng)時(shí)，屬于有性繁殖，來源不同的“+”、“－”菌的菌絲體互相接觸，發(fā)生原生質(zhì)和細(xì)胞核的結(jié)合，生成接合孢子，最后減數(shù)分裂形成單倍的營養(yǎng)體——三孢酸。發(fā)酵培養(yǎng)階段，在三孢酸刺激作用下，菌體合成大量類胡蘿卜素，從而提高了發(fā)酵產(chǎn)率。已有的研究結(jié)果也證實(shí)了它的促進(jìn)作用，在利用Blakelea trispora發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的過程中添加外源性的三孢酸，其發(fā)酵水平可提高2～15倍［7］。

不但三孢酸具有促進(jìn)類胡蘿卜素生產(chǎn)的作用，就是 α-紫羅酮、β-紫羅酮、VA、脫落酸、異煙肼、琥珀酰亞胺、檸檬油萜烯和芳香族化合物的結(jié)構(gòu)類似物也有此性質(zhì)，它們的加入均能提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量，從而提高番茄紅素的產(chǎn)量［8］。通過三孢酸結(jié)構(gòu)類似物結(jié)構(gòu)式的分析，可以確定當(dāng)化合物必須具備1個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)并帶1個(gè)酮基和1個(gè)的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)才具有這種生物活性。

2 抗氧化劑

番茄紅素易于氧化，因而在發(fā)酵過程中添加抗氧化劑會(huì)防止番茄紅素的氧化，從而提高產(chǎn)量。秦敬改［9］在研究抗氧化劑BHT對三孢布拉霉發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加1g/L的BHT時(shí)類胡蘿卜素產(chǎn)量提高30%。劉海麗［10］添加0.025%的抗氧化劑Ethoxyquin，發(fā)現(xiàn)對類胡蘿卜素產(chǎn)量的增長有顯著作用，可使產(chǎn)量增加70%。

3 氧載體與表面活性劑

在發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素中，三孢布拉霉是高度嗜氧的微生物，從發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方面去改善培養(yǎng)介質(zhì)的性能，可以通過添加氧載體、表面活性劑［11］提高同一反應(yīng)系統(tǒng)的傳氧系數(shù)來提高番茄紅素的產(chǎn)量。研究報(bào)道，添加非離子表面活性劑Span-20不僅可以改變?nèi)卟祭咕l(fā)酵液流體特性和細(xì)胞通透性，而且更重要的是它是水溶性表面活性劑，形成的分散型菌絲體更加有利于細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的傳遞并營造利于番茄紅素合成的有利條件，因而可使番茄紅素生產(chǎn)能力大幅度提高［12］。

朱艷［13］在發(fā)酵第1天的時(shí)候添加H2O2到發(fā)酵體系中，可以提高番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到40%。在發(fā)酵剛開始分別加入1%的氧載體——正己烷、正十二烷，可使產(chǎn)量分別提高25%和72%。并且在添加氧載體的同時(shí)，進(jìn)行了各種表面活性劑的添加實(shí)驗(yàn)，選取了 Span20、Tween20、Tween80和 Triton-x100為代表，進(jìn)行了復(fù)合實(shí)驗(yàn)，番茄紅素產(chǎn)量大幅提高，最高可提高114%，優(yōu)于單一添加氧載體或表面活性劑。

王常玲［14］在發(fā)酵過程6h時(shí)，添加0.13%的表面活性劑大豆卵磷脂，番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到最大值1.58 g/L，比對照提高了56.44%。劉淑惠［15］研究了發(fā)酵液中加入活性炭，利用活性炭吸附氣體的性質(zhì)，增加發(fā)酵液中溶解氧的濃度，改善發(fā)酵液黏度，促進(jìn)三孢布拉霉菌的生長，番茄紅素的產(chǎn)量提高為原產(chǎn)量的150%以上。

4 前體物質(zhì)

前體物質(zhì)指某一代謝中間體的前一階段的物質(zhì)。例如葡萄糖是糖原或乳酸的前體物質(zhì);原葉綠素是葉綠素的前體物質(zhì);原維生素是維生素的前體物質(zhì)。一般在生物合成反應(yīng)的中間過程中，某一階段前的物質(zhì)，都可以說是該階段物質(zhì)的前體物質(zhì)。按慣例是不包括極簡單的原料物質(zhì)的。在生物合成番茄紅素的過程中，初級代謝產(chǎn)物以及中間代謝產(chǎn)物都可以看作是番茄紅素的前體物質(zhì)。

三孢布拉霉生物合成番茄紅素的途徑復(fù)雜，但是已基本探明了番茄紅素及相關(guān)類胡蘿素的生物合成途徑(圖1)。已有的研究表明，初級代謝中間產(chǎn)物檸檬酸、烏頭酸、蘋果酸和琥珀酸對番茄紅素的合成均有一定的促進(jìn)作用，以檸檬酸的促進(jìn)作用最為顯著［16］。王常玲［17］在發(fā)酵 24h 添加 2.0% 的檸檬酸時(shí)，番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到 0.99 g/L，比對照提高了39.43%。也有文獻(xiàn)報(bào)道，添加檸檬酸鹽和蘋果酸鹽可刺激三孢布拉霉菌體內(nèi)類胡蘿卜素的合成［18］。

5 激活代謝途徑中的相關(guān)酶的活性的物質(zhì)

5.1 青霉素

青霉素可以刺激MVA激酶的酶活(圖1)，從而可以增加類胡蘿卜素前體物質(zhì)異戊二烯焦磷酸(IPP)的合成，有利于代謝流向番茄紅素合成轉(zhuǎn)移［16］。解書懷［18］在發(fā)酵后第一天添加1 mg/L 的青霉素，番茄紅素產(chǎn)量提高32%。

5.2 花生四烯酸(AA)

劉淑惠［15］在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，添加AA(花生四烯酸，類二十烷酸的前體，類二十烷酸是很多生化過程中的重要調(diào)節(jié)劑)，可以提高番茄紅素產(chǎn)量，達(dá)到47%。添加依據(jù)是 Rodriguea-Concepcion等［19］使用AA處理過番茄后發(fā)現(xiàn)，HMGR(3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A)還原酶被認(rèn)為是MVA途徑中的第一個(gè)限速酶，是細(xì)胞質(zhì)萜類化合物的代謝中的重要調(diào)控點(diǎn))的活性提高了，并且促進(jìn)了番茄紅素的合成。毛霉目真菌番茄紅素的代謝途徑與植物體內(nèi)合成番茄紅素的代謝途徑相似，并且存在相同功能的一套代謝酶系。因此可知，花生四烯酸刺激并提高了真菌三孢布拉氏霉中的HMGR的活性，促進(jìn)了番茄紅素的累積。

5.3 試劑A(HMG-CoA)

圖1 真菌中類胡蘿卜素的代謝途徑

在類胡蘿卜素生物合成途徑中，HMG-CoA reductase催化HMG-CoA形成甲羥戊酸(MVA)，由于MVA的形成是一個(gè)不可逆過程，因此，HMG-CoA reductase被認(rèn)為是動(dòng)物、植物、真菌可能也是昆蟲的類異戊二烯代謝途徑的一個(gè)限速酶。許多研究者都報(bào)道，異戊二烯生物合成途徑的誘導(dǎo)，尤其是倍半萜類物質(zhì)的合成，與HMG-CoA reductase活性成正相關(guān)。在類胡蘿卜素生物合成途徑中(圖1)，試劑A可使HMG-CoA reductase酶活增加2倍，從而可以增加類胡蘿卜素前體物質(zhì)異戊二烯焦磷酸(IPP)的合成，提高番茄紅素的產(chǎn)量。解書懷［18］在添加試劑A后，刺激三孢布拉霉類胡蘿卜素合成代謝途徑中試劑A代謝，使HMG-CoA reductase酶活提高兩倍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在發(fā)酵第1天添加0.05%的試劑A，可使番茄紅素產(chǎn)量提高31%，最大達(dá)到1.49 g/L。

6 金屬離子和鹽

微生物在生長繁殖和產(chǎn)物合成中都需要無機(jī)鹽和微量元素，而且這些離子的生物學(xué)作用各不相同。文獻(xiàn)報(bào)道:三布拉霉菌兩性株混合培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)，添加微量(0.01 mol/L)銅離子、鎂離子、鐵離子可增加胡蘿卜素合成的速率，并使得終產(chǎn)物的產(chǎn)量增加幾倍。

Mg2+是物質(zhì)代謝過程中許多酶的輔助因子或激活劑，參與酶促反應(yīng)，激活酶活性，Mn2+對生物生長及次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)具有較大的影響，而且Mn2+對番茄紅素的穩(wěn)定性影響不大，徐軍偉［20］通過添加及改變培養(yǎng)基中的Mn2+、Mg2+量來考察微量元素對發(fā)酵的影響，結(jié)果如下:在發(fā)酵過程中添加Mn2+，菌體生物量和番茄紅素的產(chǎn)率與對照試驗(yàn)相比都有較明顯的提高。說明Mn2+對發(fā)酵有較大的影響。發(fā)酵液中當(dāng)濃度較低時(shí)，能夠促進(jìn)菌體生長和番茄紅素合成，但當(dāng)Mg2+過高時(shí)，菌體生物量和番茄紅素產(chǎn)率反倒降低，可能較高的Mg2+濃度對三抱布拉氏霉菌產(chǎn)生毒害作用，抑制菌體生長和產(chǎn)物合成。

7 番茄紅素環(huán)化酶抑制劑

番茄紅素環(huán)化酶是三孢布拉霉菌合成番茄紅素到β-胡蘿卜素所需的酶，生物法生產(chǎn)番茄紅素的關(guān)鍵步驟就是添加番茄紅素環(huán)化酶抑制劑，打斷番茄紅素至β-胡蘿卜素的環(huán)化反應(yīng)，使代謝流停留在番茄紅素階段。常見的番茄紅素環(huán)化酶抑制劑有兩類:一類為叔胺類化合物，主要包括對二甲氨乙基苯酚、2-二甲氨基-乙醇、2-二甲氨基-1-丙醇、1-二甲氨基-2-丙醇、3-二異丙基氨基-1-丙醇、1-二異丙基氨基-2-丙醇、三乙胺、2-二甲氨基乙苯等［21］;另一類是含氮類雜環(huán)化合物，如煙堿、咪唑、吡啶、嗎啉、吡啶、哌啶、喹啉和某些取代衍生物［22］。目前由于叔胺類化合物毒性較大，在微生物法生產(chǎn)番茄紅素中較少應(yīng)用。徐娜等［23］對不同阻斷劑作用效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)咪唑、煙堿、N-甲基嗎琳、吡啶及哌啶均可促進(jìn)三孢布拉霉累積番茄紅素，但前三者的效果優(yōu)于吡啶及哌啶，發(fā)酵產(chǎn)物中β-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素較少。考慮到工業(yè)生產(chǎn)成本，還考察了廢棄煙渣水抽提物對此菌產(chǎn)生番茄紅素的影響，結(jié)果表明在一定條件下，加入廢棄煙渣水提物可使番茄紅素的積累量從對照的1.42 mg/L增加到160.3 mg/L，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

8 麥角固醇合成抑制劑

番茄紅素和麥角固醇的合成前體都是法尼基二磷酸(FPP)，通過控制麥角固醇的合成，來達(dá)到積累番茄紅素的目的(圖1)。麥角固醇合成抑制劑——十二環(huán)嗎啉、嗪氨靈、氟康唑、酮康唑 、鹽酸特比萘芬等，抑制合成麥角固醇酶的活性，使得麥角固醇產(chǎn)量降低，使得三孢布拉氏霉的類胡蘿卜素產(chǎn)量提高。孫穎［24］在發(fā)酵48h時(shí)添加0.7 mg/L的鹽酸特比萘芬和30 mg/L的酮康唑，可使番茄紅素的含量增加23%和277%。

9 結(jié)語

目前制約發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)番茄紅素的主要因素是微生物不能高水平的積累番茄紅素，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本較高。番茄紅素合成途徑復(fù)雜，構(gòu)建番茄紅素基因工程高產(chǎn)菌至今尚未取得突破性進(jìn)展。因此，篩選和尋求合適的發(fā)酵促進(jìn)劑，對提高該菌生物合成β-胡蘿卜素與番茄紅素的能力，降低生產(chǎn)成本，增加大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的技術(shù)可行性，將會(huì)有很大的實(shí)際意義。

綜上所述，試驗(yàn)研究所用的發(fā)酵促進(jìn)劑種類很多，大多數(shù)對番茄紅素的發(fā)酵作用是肯定的，隨著研究的不斷深入，作用顯著、使用方便的發(fā)酵促進(jìn)劑將會(huì)在番茄紅素生產(chǎn)中得到普遍應(yīng)用。

［1］ Krinsky N I，Johnson E J．Carotenoid actions and their relation to health and disease［J］．Molecular Aspects Med，2005，26(6):459－516.

［2］ 柳巧寧，朱麗雯，王義華，等．發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的研究進(jìn)展［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(6):157－158.

［3］ 姜文侯，單志萍，孟妤．微生物產(chǎn)生的類胡蘿卜素及其工業(yè)化［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，1998，25(3):46 －48.

［4］ Mantzouridou F，Tsimidou M Z．Lycopene formation in Blakeslea trispora．chemical aspects of a bioprocess［J］．Trends in Food Science＆ Technology，2008，19(7):363－371．

［5］ 龔平，闞建全．番茄紅素的研究進(jìn)展［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，35(4):143 －145.

［6］ 王歲樓，張平之．β-胡蘿卜素的生物合成與發(fā)酵促進(jìn)劑［J］．生物學(xué)雜志，2000(3):4 －5．

［7］ 王見冬，袁其朋，錢忠明．β-胡蘿卜素發(fā)酵過程中關(guān)鍵的代謝產(chǎn)物——三孢酸［J］．微生物學(xué)通報(bào)，2004，31(3):147－150．

［8］ 王航．發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的工藝研究［D］．北京:北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006:36－44.

［9］ 秦敬改．發(fā)酵法生產(chǎn)β-胡蘿卜素［D］．北京:北京化工大學(xué)，2003:55－57.

［10］ 劉海麗，余曉斌．表面活性劑和抗氧化劑對三孢布拉霉合成β-胡蘿卜素的影響［J］．食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，26(2):97 －101.

［11］ 朱艷，袁其朋，王航．添加氧載體及表面活性劑對番茄紅素發(fā)酵的影響［J］．微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(1):90－94.

［12］ Seon-Won Kim，Weon-Taek Seo，Young-Hoon Park，Enchanced Production of β-Carotene from Blakeslea trispora with Span-20［J］．Biotechnology Letters，1997，19(6):561－56.

［13］ 朱艷．發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素及萃取分離的研究［D］．北京:北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文，2005:31－38.

［14］ 王常玲，顧秋亞，余曉斌．初級代謝產(chǎn)物和有性生殖促進(jìn)劑對番茄紅素發(fā)酵的影響［J］．生物加工過程，2009(7):40－44.

［15］ 劉淑惠，袁其朋．一種提高三孢布拉霉菌番茄紅素產(chǎn)量的方法［P］.中國，CN200910084373.0，2009－10－14.

［16］ Sheetal M Choudhari，Laxmi Ananthanarayan，et al．Use of metabolic stimulators and inhibitors for enhanced production of β-carotene and lycopene by Blakeslea trispora NRRL 2895 and 2896［J］．Bioresource Technology，2008，99(8):3 166 －3 173．

［17］ Bhosale P．Environmental and cultural stimulants in the production of carotenoids from microorganisms［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2004，63(4):351－361.

［18］ 解書懷．三孢布拉氏霉生產(chǎn)番茄紅素的研究［D］．無錫:江南大學(xué)碩士學(xué)位論文，2008:30-34.

［19］ Rodriguea-cocepcion M，Gruissem W．Arachidonic acid alters tomato HMG expression and fruit grouth and induces 3-hydroxy-3-methylg lutraryl coenzyme A reductase-independent lycopene accumulation［J］．Plant Physiol，1999，119(1):41－48．

［20］ 徐軍偉．利用Blakeslea trispora發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素生產(chǎn)工藝的研究［D］．北京:北京化工大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006:34－41.

［21］ Phillip D M，Young A J．Preferential inhibition of the lycopene ε-cyclase by the substituted triethylamine compound MPTA in higher plants［J］．Journal of Plant Physiology，2006，163(4):383 － 391.

［22］ 王見冬，王永生，袁其朋，等．吡啶類化合物對三孢布拉氏菌代謝途徑的影響［J］．現(xiàn)代化工，2003(23):202－204.

［23］ 徐娜，鄭附，許激揚(yáng)．環(huán)化酶抑制劑對三抱布拉霉產(chǎn)生番茄紅素的影響［J］．中國抗生素雜志，2006(31):372－374.

［24］ Ying Sun，Qi-Peng Yuan，F(xiàn)rank Vriesekoop.Effect of two ergosterol biosynthesis inhibitors on lycopene production by Blakeslea trispora［J］．Process Biochemistry，2007，42(10):1 460 －1 464.