葡萄酒中氨基甲酸乙酯的含量測定及釀造工藝對其含量的影響*

于英，李記明，沈志毅，姜文廣

(張裕集團有限公司技術中心，山東煙臺，264001)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，簡稱為EC)存在于多數發酵食品中［1－2］。它具有致癌性，世界衛生組織對軟飲料中EC制定了限量標準，我國在酒精飲料和發酵食品中尚未制定限量標準。隨著人民生活水平的提高，我國酒飲料的消費量日趨上升，尤其是葡萄酒、黃酒、啤酒等營養豐富的含酒精飲料更是人們消費的熱點，因此制定酒精飲料中氨基甲酸乙酯限量標準勢在必行。

葡萄酒中的EC主要是由尿素和乙醇反應形成的，其次由氨甲酰磷酸和瓜氨酸與乙醇反應生成［3－5］。尿素和乙醇生成EC的反應式如下:

H2NCONH2+C2H5OH→H2NCO2C3H5+NH3

在葡萄酒釀造中影響尿素含量的因素很多。一是在葡萄生長過程中，添加氮源會使發酵的葡萄酒中尿素含量增加;二是酵母發酵過程中，加入尿素作為氮源;三是在酵母菌株本身內部代謝由精氨酸分解產生尿素［6－7］。影響EC生成量的因素除尿素和乙醇濃度外，還有酵母和乳酸菌菌株的種類、葡萄汁中α-氨基酸態氮的含量、發酵及貯藏溫度等，其中發酵和貯存溫度對EC的形成影響最大，加熱可以加快EC的形成［8－10］。在葡萄酒的貯藏過程中，仍存在乙醇和尿素形成EC的反應，但此階段形成的EC的速度較慢［11］。

本文研究的主要目的是分析葡萄酒釀造工藝條件對氨基甲酸乙酯生成的影響，以建立降低氨基甲酸乙酯生成量的釀造工藝條件;對我國不同類型的干紅和干白葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量情況進行調研，為我國葡萄酒安全標準中氨基甲酸乙酯限量指標提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

釀酒葡萄原料:蛇龍珠(Cabernet Gernischt)，采摘于張裕公司葡萄基地。

葡萄酒樣品:77款(或批次)干紅葡萄酒和17款干白葡萄酒從市場采購。

釀酒酵母:Y1和Y2購于上海杰兔工貿有限公司。

果膠酶:果膠酶P1購于上海杰兔工貿有限公司;P2、P3和P4均購于法國諾盟集團。

乳酸菌:MLB1、MLB2和MLB3均購于上海杰兔工貿有限公司。

藥品:乙醚、正己烷、甲醇購自上海國藥集團(分析純)，乙醇購自Sigma公司。

試劑標準品:氨基甲酸乙酯(EC)(純度 ＞99%)、內標物氨基甲酸丙酯(PC)(純度＞98%)均購自美國Sigma公司。

1.2 實驗儀器

氣相色譜Varian GC-3800氣相色譜儀，配有氫火焰離子化檢測器(美國Varian公司);DC-12氮吹儀，上海安譜公司;Cleanert Silica固相萃取柱，北京艾杰爾科技有限公司。

1.3 實驗設計

1.3.1 工藝路線

葡萄原料→除梗破碎(添加30 mg/L SO2)→酒精發酵(25～28℃)→分離→壓榨→蘋果酸－乳酸發酵→分離→下膠→穩定性處理→過濾→裝瓶

1.3.2 設計方案

本研究分A、B、C、D 4個試驗組，18個處理。

(A)酵母研究:分4個處理進行，A1添加酵母Y1(250 mg/L)、A2添加酵母 Y1(400 mg/L)、A3添加酵母Y2(250 mg/L)、A4添加酵母Y2(400 mg/L)，添加果膠酶P1(25 mg/L)，不進行蘋果酸乳酸發酵，參照工藝路線釀造。

(B)酒精發酵溫度研究:分3個處理進行，添加果膠酶 P1(25 mg/L)和酵母 Y1(250 mg/L)，B1、B2、B3分別在30、25、15℃溫度下發酵，不進行蘋乳發酵，參照工藝路線釀造。

(C)果膠酶研究:分7個處理進行，添加酵母Y2(250 mg/L)，C1、C2、C3 和 C4 在酒精發酵前分別加入果膠酶 P1、P2、P3和 P4(按推薦用量);C5、C6和C7在酒精發酵結束分汁后，分別添加果膠酶P2、P3和P4(按推薦用量)，不進行蘋果酸乳酸發酵，參照工藝路線釀造。

(D)乳酸菌研究:分4個處理進行，添加酵母Y1(250 mg/L)，酒精發酵結束后分離，D2、D3、D4 分別加入乳酸菌MLB1、MLB2和MLB3(按推薦用量)，D1自然蘋乳發酵作為對照，進行蘋果酸-乳酸發酵，參照工藝路線釀造。

1.4 氨基甲酸乙酯的測定

1.4.1 樣品處理

取5.0 mL乙醇加到Cleanert Silica固相萃取柱上，活化萃取柱，然后取5.0mL酒樣，加到萃取柱上，靜止使之吸附10min，先用10mL正己烷淋洗除雜，然后用10 mL乙醚將氨基甲酸乙酯洗脫收集，將洗脫液通過氮吹儀濃縮，最后用無水乙醇定容至0.5 mL，振蕩混勻，過0.45μm微孔濾膜，待分析。

1.4.2 色譜條件

色譜柱為SUPELCOWAXTM-10石英毛細管柱(60 m ×0.32 mm ×1.0 μm)，進樣口溫度 200℃，檢測溫度210℃，柱溫程序:初溫50℃，保持1 min，然后以10℃/min升至150℃，再以3℃/min升至220℃，保持5 min;載氣流速1.0 mL/min，不分流進樣，進樣量2.0 μL。

1.4.3 標準品曲線的建立

分別取10.0 mg EC和氨基甲酸丙酯于10 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，存放在冰箱中備用;標準使用液:取1 000 mg/L儲備溶液，用乙醇稀釋使用。

將不同濃度的EC標準溶液從低濃度到高濃度加入內標依次進樣，對應于內標物作標準曲線。

1.4.4 樣品檢測

將處理好的試樣，加入內標進樣分析，根據保留時間確定峰的位置，并根據峰面積，利用標準曲線計算出試樣中EC的含量。

2 結果與分析

2.1 葡萄酒中EC定性分析

本研究葡萄酒樣中EC的鑒定主要通過與標準品的保留時間相比來完成，如圖1和圖2所示，圖1為EC和內標物氨基甲酸丙酯標準品的色譜圖，圖2為蛇龍珠葡萄酒中EC和內標物氨基甲酸丙酯的色譜圖。

圖1 EC標準色譜圖

圖2 葡萄酒樣品氨基甲酸乙酯色譜圖

2.2 酵母菌對EC生成量的影響

釀酒酵母代謝精氨酸以及尿素的分泌具有菌株特異性，釀造過程葡萄汁中精氨酸可在酵母菌內代謝產生過量的尿素，酵母菌將其從胞內釋放到發酵液中，導致葡萄酒中尿素含量升高，過量的尿素和乙醇反應生成EC［6－7］。本文研究了釀造過程中酵母Y1和Y2對氨基甲酸乙酯產生的影響。具體結果如表1所示，所研究的2種酵母菌生成EC含量存在一定差異。在接種量250 mg/L條件下，酵母Y1的EC生成量比酵母Y2少38.8%;而在接種量400 mg/L情況下，酵母Y1的EC生成量比酵母Y2多26.5%。增加接種量，2種酵母的EC生成量表現不同，酵母Y1的EC生成量增加，而酵母Y2降低，這可能與酵母代謝精氨酸以及分泌尿素的能力差異有關。

表1 不同酵母菌的EC生成量 μg/L

2.3 發酵溫度對EC生成量的影響

在表2中列出了葡萄酒在30℃、25℃、15℃進行酒精發酵EC的生成情況。可看出:隨著發酵溫度升高，EC生成量呈增加趨勢。這主要由于溫度升高，由尿素產生EC的速度會增加，從而使EC的生成量增加［11］。因此降低酒精發酵溫度可以減少葡萄酒中EC的含量。

表2 不同發酵溫度下EC的生成量

2.4 果膠酶對EC生成量的影響

本研究比較了4種果膠酶及其添加時間對葡萄酒中EC生成的影響，具體結果如表3所示。釀造過程中使用不同果膠酶對葡萄酒中EC的含量有影響，C4中EC含量最高(21.5μg/L);C2中EC含量最低，僅為7.4μg/L，其次是 C1(10.3μg/L)，也相對較低。酒精發酵結束分離皮渣后添加果膠酶的酒樣中EC含量比發酵前添加均有所增加，樣品C5比C2中EC含量增加了141.9%，C6比C3增加了51.4%，C7比C4增加了1.9%。

表3 不同果膠酶的EC生成量

目前有關果膠酶的使用對葡萄酒中EC含量影響研究尚未見報道，葡萄酒釀造過程中使用果膠酶可以促進果膠的水解，浸提更多酚類物質，增加葡萄漿的澄清度，可調節葡萄發酵醪中蛋白物質含量(如單寧和蛋白聚合、膠體蛋白的沉淀等)。本研究發現酒精發酵過程中商業果膠酶的使用不會增加葡萄酒中EC的含量，與不添加果膠酶發酵相比較，添加果膠酶發酵葡萄酒中EC含量會低一些。

2.5 乳酸菌對EC生成量的影響

葡萄酒蘋－乳發酵階段乳酸菌通過精氨酸脫亞氨基酶途徑代謝生成瓜氨酸，該物質為EC的前體物之一［12］。本研究比較了添加乳酸菌進行蘋果酸－乳酸發酵對EC生成的影響，結果如表4所示。添加不同的乳酸菌進行蘋果酸乳酸發酵后，EC的生成量均有所增加。與D1自然蘋乳發酵相比，對照D2添加乳酸菌MLB1的葡萄酒中EC生成量增加了5.6%;D3添加乳酸菌MLB1增加了10.3%;D4添加乳酸菌MLB1產生EC量最大，增加了140.2%。

表4 不同乳酸菌對EC生成量的影響

2.6 國產葡萄酒中的EC含量調查

本研究對國內不同類型的77款(或批次)干紅葡萄酒和17款干白葡萄酒中EC含量狀況進行了調查。表5中研究結果顯示:干紅葡萄酒中EC含量分布在7.00～26.80 μg/L范圍內，平均濃度為17.90 μg/L。干白葡萄酒中EC含量分布在6.40～21.58 μg/L圍內，平均濃度為11.35 μg/L，明顯低于干紅葡萄酒，這由于干白葡萄酒一般不進行蘋乳發酵。葡萄酒中EC含量的差異主要與葡萄原料、產地、釀造工藝等不同有關。

表5 葡萄酒中EC的含量

3 討論

EC是一種主要產生于發酵食品和飲料中的致癌物質。近年來，各國食品安全部門有關EC的報道不斷出現，并紛紛出臺相關限量標準。目前，我國還沒有對包括葡萄酒在內的發酵飲料和食品中EC含量進行限定的標準和法規。本研究通過對國內不同類型的77款(或批次)干紅葡萄酒和17款干白葡萄酒中EC含量的測定，發現干紅葡萄酒中EC含量范圍在7.00～26.80 μg/L，干白葡萄酒中EC含量范圍在6.40～21.58 μg/L，提出葡萄酒安全標準限量指標建議:氨基甲酸乙酯限量范圍為≤30 μg/L。

［1］ Ha M S，Hu S J，Park H R，et al.Exposure assessment of ethyl carbamate in alcoholic beverages［J］．J Microbio Biotech，2006，16(3):480－483.

［2］ Park S R，Ha S D，Yoon J H，et a1.Exposure to ethyl carbamate in alcohol-drinking and nondfinking adults and its reduction by simple charcoal filtration［J］．Food Control，2009，20(10):946 －952.

［3］ Tonon T，Lonvaud-Funel A.Arginine metabolism by wine-Lactobacilli isolated from wine［J］．Food Microbio，2002，19(5):451－461.

［4］ Uthurry C A，Lepe J A S，LombarderoJ，et al.Ethyl carbamate production by selected yeasts and lactic acid bacteria in red wine［J］．Food Chem，2006，94(2):262－270.

［5］ 梁新紅，孫俊良，曾潔.葡萄酒中氨基甲酸乙酯形成及質量控制［J］．釀酒科技，2009(10):32－36.

［6］ Lepe J A S，Uthurry C A.Incidence of nitrogenous compounds of must on ethyl carbamate formation induced by lactic acid bacteria［J］．J Int Des Sci De La Vigne Et Du Vin，2007，41(4):215－223.

［7］ Liu S Q，Pritchard G G，Hardman M J，et a1.Arginine catabolis in wine lactic acid bacteria:is it via the arginine deiminase path way or the arginase-urease pathway［J］．J Appl Micbiol，1996，8(5):486 －492.

［8］ Coulon J，Husnik J I，Inglis D L，et al.Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae to minimize the production of ethyl carbamate in wine ［J］．Am J Enol Viticult，2006，57(2):113－124.

［9］ Arena M E，and de Nadra M C M.Influence of ethanol and low pH on arginine and citrulline metabolism in lactic acid bacteria from wine ［J］．Res Microbiol，2005，156(8):858－864.

［10］ Bell S J，Henschke P A.Implications of nitrogen nutrition for grapes，fermentation and wine［J］．Aus J Grape Wine Res，2005，11(3):242－295.

［11］ Hasnip S，Caputi A，Crews C，et al.Effects of storage time and temperature on the concentration of ethyl carbamate and its precursors in wine［J］．Food Addit Contam，2004，21(12):1 155－1 161.

［12］ Liu S Q，Pritchard G G，Hardman M J，et a1.Arginine catabolis in wine lactic acid bacteria:is it via the arginine deiminase path way or the arginase-urease pathway［J］．J Appl Micbiol，1996，8(5):486 －492.