聚酰胺吸附－HPLC測定飲料和糖果中的20種水溶性色素*

顧宇翔，葛宇，印杰，虞成華，陸志蕓，劉孟鯤，馬曉飛

(上海市質量監督檢驗技術研究院/國家食品質量監督檢驗中心(上海)，上海，200233)

現代食品加工中食用色素的使用十分普遍，天然色素存在成本高、著色力差、穩定性差等缺點，合成色素色彩鮮艷、穩定性好，價格便宜，廣受食品生產廠的青睞［1－2］，但部分合成色素存在一定安全隱患［3－5］。

由于法規允許使用的合成色素的種類和涉及的食品范圍有限［6］，一些不法食品生產者受利益驅動，會超量超范圍地使用，甚至使用不可用于食品中對人體有害的色素和染料。在衛生部發布的食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單中色素類非法添加物就占到了9項。2012年發生的染色饅頭事件提示不但要著力杜絕非食用色素的使用，對于超范圍使用色素的情況也要加強監控。目前國內缺乏高通量篩選型測定方法，監督抽查中主要采用GB/T 5009.35－2003、GB/T 19681－2005、SN/T 1743 －2006 等標準［7－9］，一次只能檢測幾種物質，效率較低，日常檢測的批次數和涉及色素種類遠遠不能滿足食品安全監控的需要。

鑒于此，建立準確、方便的色素污染物多組分檢測方法迫在眉睫，這不但有利于提高檢測效率、降低監督檢驗成本，而且能增強政府食品安全應急能力。參考國內外文獻基礎［10－13］，本研究建立了一種適合于糖果、飲料的20種色素同時測定方法。之所以選取這2類產品，是因為兒童糖果、飲料消費量較大，鮮艷的顏色容易吸引他們的注意力，并且兒童的肝臟解毒功能尚不完善，更需要保護。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

2695型Waters液相色譜儀帶二極管陣列檢測器，Waters公司。

檸檬黃、麗春紅6R、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、赤蘚紅、亮藍，購自國藥集團;酸性品紅6B、酸性紅、酸性藍1號、酸性綠、熒光桃紅B、萘酚黃S、堅牢綠，購自Sigma公司;新紅、偶氮紅玉、靛藍、專利藍5號，購自Dr．Ehrenstorfer公司;酸性玫瑰紅，購自東京化成工業株式會社;孟加拉玫瑰紅，購自Alfa Aesar公司。

流動相乙腈和甲醇為色譜純，聚酰胺粉末為柱層析專用級別，購自國藥集團;其他試劑為分析純，均購自國藥集團;所用水為二級去離子水;樣品從市場購得。

1.2 標準溶液制備

準確稱取各標準樣品20.0 mg至100 mL容量瓶中，以水定容，制成混合標準溶液(0.200 mg/mL)，然后分別移取 1.00、2.00、5.00、10.0 和 25.0 mL 標準溶液至100 mL容量瓶中用水稀釋配制成標準系列溶液(2.00、4.00 、10.0、20.0 和 50.0 μg/mL)。

1.3 前處理方法

1.3.1 飲料前處理

非碳酸飲料類:準確稱取5 g(精確至0.01 g)樣品，置于50 mL帶蓋聚丙烯離心試管中，用去離子水定容至50 mL，漩渦振蕩器混合均勻樣品。如果提取液混濁，需8 000 r/min離心5 min取上清液。然后向試樣液中加入1.0～1.5 g聚酰胺粉末吸附色素，振蕩混合后用布氏漏斗抽濾，保留漏斗中的粉末。用20 mL 1%醋酸分2－3次淋洗漏斗中的粉末，再用20 mL水分2～3次淋洗，接著用15 mL 1%V(氨水)∶V(甲醇)=1∶1分2～3次洗脫漏斗中吸附了色素的聚酰胺粉末。收集洗脫液后旋轉蒸發至近干并用水定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾器經一次性針筒壓濾后即可得到澄清的樣品溶液。

碳酸飲料類:準確稱取5 g(精確至0.01 g)樣品，置于50mL帶蓋聚丙烯離心試管中，在超聲振蕩儀中超聲10 min除氣，用去離子水定容至50 mL，之后處理方法同非碳酸飲料類。

1.3.2 糖果的前處理

取樣5 g(精確至0.01 g)樣品，置于50 mL帶蓋聚丙烯離心試管中，加入40 mL水后水浴加熱超聲溶解樣品，完全溶解后用水定容至50 mL，之后處理方法同非碳酸飲料類。

1.4 色譜條件

色譜柱:XDB-C18(5 μm，4.6 mm × 250mm)，柱溫:30℃，流速:1 mL/mL，進樣量一般為 20 μL。

表1 流動相配比

1.5 檢出限的確定

在所建立的前處理和色譜條件下，將不含任何色素的陰性樣品提取后分別進樣6次，以3、10倍陰性樣品空白的標準偏差分別計算定性和定量檢出限。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

由于各種色素有不同的特征吸收波長，為了方便測定，根據這20種色素吸收峰的情況，確定了3個檢測波長，分別為450、520和620 nm。它們的吸收光譜峰形可作為定性判定依據，但在極低含量時峰形會出現變化，需要注意辨別(圖1～圖3)。

2.2 前處理方法的影響

飲料類雜質少，易混合均勻，可以直接水浸提。采用聚酰胺粉末吸附-洗脫-濃縮是為了降低檢出限，很多含色素量較高的飲料不需要此步驟亦可直接檢測。但糖果基質較復雜，必須采取相應的提純手段。

表2 色素的名稱、吸收波長、檢測波長和保留時間

圖1 450 nm波長下的標樣色譜圖

圖2 520 nm波長下的標樣色譜圖

本研究對比了聚酰胺粉末吸附-洗脫-濃縮步驟使用與否對糖果檢測的影響，圖4為硬糖樣品直接水浸提的色譜圖，圖5為該樣品經提純步驟的色譜圖，可見該前處理方法對于降低基質干擾有較大幫助，色素基本未損失。

圖3 620 nm波長下的標樣色譜圖

圖4 硬糖樣品直接水提色譜圖

圖5 硬糖樣品經提純后色譜圖

2.3 檢出限和標準曲線

在所建立的條件下，以3、10倍陰性樣品空白的標準偏差計算出定性和定量檢出限。考慮到實際樣品基質的復雜性，故最終確定的檢出限留有一定余量:定性檢出限為0.03～0.3 mg/kg，定量檢出限為0.1 ～1.0 mg/kg。

各色素在2.0～50 μg/mL之間其含量與響應值成正比，相關系數R2＞0.999。

2.4 重復性

將某飲料和糖果分別按上述方法提取并測定6次，飲料和糖果樣品計算所得的相對標準偏差(RSD)分別為0.77%～7.8%和0.51% ～7.6%。

2.5 回收率

取不同量的混合色素標準溶液，分別加入飲料和糖果樣品中檢測，得加標回收率在71.4% ～109.2%之間。

表3 檢出限和標準曲線

表4 樣品加標回收率

2.6 穩定性

分別將標樣和同一樣品的提取液在制樣后0，4，8和24 h測定，數據表明色素的含量并不存在顯著性差異，穩定性良好。

2.7 實際樣品分析

對市售50種飲料和糖果進行了測定，其中14種檢出了檸檬黃、亮藍、莧菜紅和誘惑紅中的一種或幾種，含量在0.53～18.6 mg/kg。各樣品添加的色素種類、范圍及其用量都在法規允許的范圍之內，未出現非食用物質的添加。此次樣品主要購自大型超市，供貨商均有一定規模，入市之前也經過了例行檢測，以后采樣因著眼于城鄉接合部、農村等監管薄弱的地區，更易發現問題。

圖6 水果糖果樣品色譜圖

圖7 碳酸飲料樣品色譜圖

3 結論

本研究建立了聚酰胺吸附－HPLC測定飲料和糖果中的20種水溶性色素的方法，該方法準確、快速、有效降低基質干擾，適用于監管和檢驗部門對產品中色素的監測，有利于提高食品中色素污染物的檢測效率、降低檢驗成本，對于規范市場上色素的標注和使用有重要的意義。

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