冷藏溫度下真空包裝牛肉微生物及品質變化*

邱淑冰，張一敏，羅欣

(山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安，271018)

肉品真空包裝是延長肉品貨架期的有效方法，適合于長期貯存和長距離運輸，因此，真空包裝從初始包裝、運輸到零售都得到廣泛應用［1］，也是現在消費市場主要銷售包裝形式［2］。真空包裝能抑制肉中常見的一些食源性致病微生物和腐敗微生物的生長，但并不能完全抑制所有微生物的生長，一些厭氧和兼性微生物仍然可以生長。研究顯示:假單孢菌屬、腸桿菌屬、熱殺索絲菌屬、乳酸菌屬均能導致真空包裝肉品的腐敗［2－3］。

目前，真空包裝作為廣泛應用于冷卻牛肉的包裝形式，十分有必要了解該包裝條件下貯藏過程中，產品的微生物數量變化及品質變化情況。因此，本課題通過測定真空包裝冷卻牛肉品質變化及多種微生物生長變化，確定了此種包裝下冷卻牛肉貯藏過程中微生物的變化趨勢、理化指標的變化規律及各指標的相關關系，為客觀評價真空包裝形式下的冷卻牛肉的貨架期提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與樣品處理

從山東某肉牛屠宰基地取四條常規屠宰、成熟48h牛背最長肌(西冷)。無菌操作將牛背最長肌修去筋腱后，垂直于肌纖維方向切成大約(50±5)g牛肉切片。每一牛肉切片在無菌條件下放入真空包裝袋中，抽氣封口，其真空度為99%，然后分別放置在4℃恒溫箱中。4℃條件下分別測定其第0，7，13，21，28，38天的相應指標。

真空包裝袋:河北雄縣旭日包裝有限公司。材質為PA/PE復合，透氧率＜15 cm3/24 h(25℃)，厚度為0.08 mm。

1.2 儀器與設備

GB204分析天平、MP120pH計，瑞士，Mettler Toledo;DZ-400型真空包裝機，山東小康機械有限公司;LDZX立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠;DHG-9240A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司;Bag Mixer400均質器，法國，Interscience;SPX-400智能型生化培養箱，寧波江南儀器廠;DKS28電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司;UDK-126D半自動凱氏定氮儀，意大利WELP公司;centrifuge5415D離心機，德國，Eppendorf;SP62色差計，美國，愛色麗 X-Rite等。

1.3 方法

1.3.1 細菌總數的測定

每隔相應時間，在無菌操作條件下，取肉樣25 g置于均質拍打袋中，加入225mL滅菌蛋白胨生理鹽水，用均質器拍打60 s，然后按10倍遞增稀釋到所需稀釋度，按照GB4789.2－2008《食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定》用稀釋平板法測定細菌總數。

1.3.2 乳酸菌、腸桿菌、熱殺索絲菌、假單胞菌數的測定

操作同1.3.1。采用不同的選擇培養基進行細菌培養，并測定菌落總數。各種培養基及培養條件見表1。

表1 培養基及培養條件

1.3.3 pH值的測定

采用便攜式pH計按照GB 9695.5－2008《肉與肉品pH測定》中的方法測牛肉的pH值。每個樣品至少重復4次。

1.3.4 揮發性鹽基氮(TVBN)的測定

每隔相應時間取肉樣10.00 g絞碎攪勻，分別置于錐形瓶中，加入100 mL水，不時振搖，浸漬30 min后離心(5 000 r/min，5 min)，上清液置冰箱備用。按照GB/T5009.44－2003半微量凱氏定氮法測定揮發性鹽基氮含量。

1.3.5 失水率的測定

低速離心法［4］:離心速度為 5 000r/min，離心 5 min，試樣3 g，試樣形狀為:(1.5×1.5×0.5)cm。

1.3.6 色差值的測定

打開真空包裝袋0.5 h后，進行色差測定［6］。取相應肉樣用X-rite SP62便攜式色度儀測定CIE L*a*b*(L*為亮度值，a*為紅(+)－綠值(－)，b*為黃(+)－藍(－)值)。每個樣品至少測定6個位點，取平均值，并計算C*ab的值。C*ab為色度飽和度。C*ab=［(a*2+b*2)］1/2。

1.4 數據處理

數據統計采用Sigma Plot 11.0進行作圖分析，SAS 9.0統計軟件進行顯著分析和相關性分析。

2 結果分析

2.1 真空包裝牛肉在冷藏溫度下菌落總數與乳酸菌變化

從圖1可以看出:真空包裝牛肉其初始菌落數為4.2 lgCFU/g，在貯藏初期，菌落總數其生長變化較快，21 d時達到最大生長水平，約為108CFU/g，此后基本保持不變。據報道，在低溫下，肉中微生物的最大生長量為 107～109CFU/g［7］，這與本研究結論一致。Liu認為肉品開始腐敗時，肉中的菌落數量達到了7 ～ 9 lgCFU/g［8］。

圖1 4℃真空包裝牛肉菌落總數和乳酸菌變化

諸多研究證實乳酸菌是真空包裝食品的主要腐敗菌［1，9］。從圖1可以看出:乳酸菌的生長趨勢與菌落總數大致相同。21 d時，已達到生長最高水平，約為108CFU/g。

2.2 真空包裝牛肉在冷藏溫度下假單胞菌、熱殺索絲菌、腸桿菌生長變化

圖2 4℃真空包裝牛肉腸桿菌、熱殺索絲菌、假單胞菌變化

如圖2所示，腸桿菌和熱殺索絲菌的初始菌量很少，之后生長迅速。腸桿菌能在低溫下生長，屬于兼性好氧微生物，是肉品中的常見菌。該菌在真空包裝的冷卻牛肉中數量不是很高，后期生長僅達到104CFU/g。熱殺索絲菌也是冷卻肉中的常見菌，尤其是在真空包裝和氣調包裝的肉品中。熱殺索絲菌生長迅速，后期達到106CFU/g。假單胞是好氧革蘭氏陰性菌，諸多研究表明為有氧貯藏條件下的主要腐敗菌，假單胞同樣為真空包裝的主要腐敗菌，主要與真空包裝條件袋的透氧率有關［10］。從圖2可以看出，假單胞的初始菌量較高，這可能因為前期在屠宰、分割、成熟過程中，假單胞菌存在并生長，在貯藏后期達到106CFU/g，這一水平與Pennacchia的研究結果一致［11］。

2.3 真空包裝冷卻牛肉在不同貯藏溫度下pH值變化

圖3 4℃下真空包裝牛肉pH的變化

新鮮肉的pH值一般為pH5.4～5.8。肉類在低pH值的情況下能保持較好的肉品品質［15］。從圖3中可以看出:肉品初始pH值為pH5.6左右。在貯藏初期，其pH值降低，呈下降趨勢，微生物首先利用肉表面的葡萄糖等碳水化合物，產生乳酸等酸性物質，酸類物質積累使pH值減低;在貯藏中期變化不明顯，但貯藏后期pH值顯著上升，主要原因為隨著貯藏時間的延長，肉中的蛋白質在細菌、酶作用下被分解為氨和胺類化合物等堿性物質而使pH值升高。4℃貯藏38 d時，其pH值上升至pH 5.64。pH值是研究肉品品質的重要指標，有研究表明:相比較于細菌數量等微生物指標，pH值等理化指標被認為是肉和肉制品微生物腐敗的化學指標［12－13］。

2.4 真空包裝冷卻牛肉在不同貯藏溫度下色澤變化

圖4 4℃下真空包裝牛肉色澤a*值、C*ab的變化

肉的顏色主要由肌紅蛋白決定，肌紅蛋白主要有3種氧化還原狀態，即由脫氧肌紅蛋白(紫紅色)、氧合肌紅蛋白(鮮紅色)和高鐵肌紅蛋白(褐色)，這3種形態對應肌紅蛋白中心鐵原子的3種配位結構。而肉類產品呈現的誘人的顏色，是與O2結合形成氧合肌紅蛋白，對肉色起決定性作用［15］。真空包裝下的肌紅蛋白，處于低氧狀態，肌紅蛋白的形式主要是脫氧肌紅蛋白，呈現暗紅色或紫色;當打開包裝袋后，O2與脫氧肌紅蛋白結合，發生氧化反應，形成氧合肌紅蛋白，呈現消費者所喜歡的鮮紅色。

L*為亮度，a*代表紅－綠變化。a*越大，表示紅度越高。b*代表黃－藍值。研究表明:a*和C*ab值能較好的反應肉品顏色變化［16］。圖4表示在冷藏溫度下，肉品a*、C*ab隨貯藏時間的變化趨勢。貯藏初期a*、C*ab升高，主要由于開始時牛肉處于有氧狀態下，肌紅蛋白和氧氣發生反應暫時生成不穩定的鮮紅色氧合肌紅蛋白［14］，隨著貯藏時間的延長，由于氧氣消耗，形成大量的高鐵肌紅蛋白，高鐵肌紅蛋白大量積累，使肉發生褐變 ，a*值下降［17］。有氧條件下，a*值在貯藏末期，下降明顯［4］，而真空包裝條件，緩解了其色澤下降趨勢，此結果與真空包裝的顏色穩定的觀點一致［18］。

2.5 真空包裝冷卻牛肉在4℃貯藏溫度下系水力和TVBN值變化

系水力變化，主要是在冷藏過程中，導致腐敗的微生物的生長繁殖需要利用牛肉中的水分，從而使得牛肉的汁液損失發生變化［4］。從圖5可以看出，4℃貯藏時，系水力基本為先上升，到后期有小幅下降。

圖5 4℃下真空包裝牛肉失水率(a)和TVB-N值(b)的變化

肉品中TVBN的來源主要是微生物對牛肉中含氮有機化合物的分解作用，即將蛋白質分解為氨基酸，并進一步通過脫羧基作用和脫氨基作用分解氨基酸產生氨或胺。GB2707－2005規定:鮮肉的衛生標準為TVBN≤15 mg/100g。在4℃條件下，貯藏時間為28 d時，TVBN值超過15 mg/100g，表明牛肉已經腐敗;隨著微生物生長繁殖，蛋白繼續分解，TVBN值繼續上升。當TVBN值達到20 mg/100g，其貯藏時間為38天時，此時牛肉嚴重腐敗，不可接受。

有學者對肉進行感官評定，但感觀評定帶有很強的主觀因素，而且只能檢測到后期的腐?。?9］。本實驗通過檢測冷卻牛肉的理化指標和微生物指標，結合變化趨勢圖可以知道隨著貯藏時間的延長，微生物數量、揮發性鹽基氮、系水力都是增長的趨勢，能客觀反映真空包裝牛肉在腐敗過程中的品質變化。

2.6 4℃條件下真空包裝冷卻牛肉微生物指標與品質指標相關性分析

冷卻牛肉在冷藏條件下微生物及各相關品質指標都發生了變化，各指標之間都是動態的變化過程，本研究應用相關性分析評價各個指標之間的關系。表2通過pearson相關系數反應微生物指標與各品質指標的相關性。肉品菌落總數與乳酸菌數都呈現極顯著相關(P＜0.01)的關系。菌落總數與TVBN值、a*值、b*值、C*ab及汁液損失顯著相關(P＜0.05)，此結論與文獻［5］結論一致，Byun與Min等研究0℃和4℃有氧貯藏條件下肉品品質變化，同樣發現:TVBN與細菌總數相關性超過0.9，并建議用TVBN作為腐敗指示指標［20］。O’Sullivan等發現，b*值與感官評定人員的評定相關［21］，這與本文b*值與菌落總數的顯著相關的結論一致，因此可以用b*值作為肉品品質腐敗指標。從表2中依然可以看出，微生物數量與pH值相關性不大(P＞0.5)，這一結果與文獻［20］結果一致。

表2 真空包裝牛肉在4℃下各品質指標的Pearson相關系數

3 結論

真空包裝牛肉在貯藏過程中，隨著時間的延長，菌落總數上升，其乳酸菌生長迅速，假單胞菌、熱殺索絲菌及腸桿菌在真空包裝下能夠生長。真空包裝有助于色澤穩定，a*值、C*ab值初期上升，后期小幅下降;對汁液損失有小幅影響。菌落總數與乳酸菌在0.01水平上呈現極顯著相關的關系，與TVBN值、a*值、b*值、C*ab及汁液損失在0.05水平上顯著相關，但與pH值相關性不大。在第28天時TVBN值超過15 mg/100g，此時牛肉已經腐敗。可以用TVBN值、a*值、b*值、C*ab作為真空包裝牛肉品質腐敗指標來確定冷卻肉的微生物污染狀況。

［1］ Pennacchia C，Ercolini D，Villani F.Spoilage-related microbiota associated with chilled beef stored in air or vacuum pack ［J］．Food Microbiology，2011，28(1):84 －93.

［2］ Castellano P，González C，Carduza F，et al.Protective action of Lactobacillus curvatus CRL705 on vacuum-packaged raw beef.Effect on sensory and structural characteristics［J］．Meat Science 2010，85(3):394－401.

［3］ Ercolini D，Ferrocino I，LaStoria A.Development of spoilage microbiota in beef stored in nisin activated packaging［J］.Food Microbiology，2010，27(1):137 －143.

［4］ 李飛燕，張一敏，王秀江，等.冷卻牛肉貯藏過程中品質變化的研究［J］．食品與發酵工業，2011，37(3):182－185.

［5］ 李苗云，張秋會.冷卻豬肉貯藏過程中腐敗品質指標的關系研究［J］．食品與發酵工業，2008，34(7):168－171.

［6］ Katikou P，Ambrosiadis I，Georgantelis D.Effect of Lactobacillus-protective cultures with bacteriocin-like inhibitory substances’producing ability on microbiological，chemical and sensory changes during storage of refrigerated vacuumpackaged sliced beef［J］．Journal of Applied Microbiology，2005，99(6):1 303 －1 313.

［7］ Borch E，Kant-Muemans M L，Blixt Y.Bacterial spoilage of meat products and cured meat［J］．Food Microbiology，1996，33(1):103－120.

［8］ Liu F，Guo Y Z，Li Y F.Interactions of microorganisms during natural spoilage of pork at 5℃［J］．Journal of Food Engineering，2006，72(1):24-29.

［9］ Sakala Rita M，Hayashidani Hideki，kato Y，et al．Change in the composition of the microflora on vacuum-packaged beef during chiller storage［J］．International Journal of Food Microbiology，2002，74(1/2):87 －99.

［10］ Koutsoumanis K P，Stamatiou A P，Drosinos E H.Control of spoilage microorganisms in minced pork by a self-developed modified atmosphere induced by the respiratory activity of meat microfiora［J］．Food Microbiol，2008，25(7):915－921.

［11］ Buys E M，Kruger J，Nortje G L.Cent ralised bulk prepackaging of fresh pork retail cuts in various gas atmospheres［J］．Meat Science，1994，36(3):292 －297.

［12］ Yano Y，Kataho N，Watanabe M，et al.Changes in the concentration of biogenic amines and application of tyramine sensor during storage of beef［J］．Food Chem，1995，54(2):155－159.

［13］ De Pablo B，Asensio M A，Sanz B，et al.The D( －)lactic acid and acetoin/diacetyl as potential indicators of the microbial quality of vacuum-packed pork and meat products［J］．J Appl Bacteriol，1989，66(3):185 － 190.

［14］ Faustman C，Specht S M，Malkus L A，et al.Pigment oxidation in ground veal:Influence of lipid oxidation，iron and zinc［J］．Meat Science，1992，31(3):351 －359.

［15］ Mancini R A，Hunt M C.Current research in meat color［J］．Meat Science，2005，71(1):100 －121.

［16］ Jakobsen M，Bertelsen G.Colour stability and lipid oxidation of fresh beef．Development of a response surface model for predicting the effects of temperature，storage tine，and modified atmosphere composition ［J］．Meat Science，2000，54(1):49－57.

［17］ Kim Y H，Keeton J T，Yang H S，et al.Color stability and biochemical characteristics of bovine muscles when enhanced with L-or D-potassium lactate in high-oxygen modified atmospheres［J］．Meat Science，2009，82(2):234－240.

［18］ Gill C O.Extending the storage life of raw chilled meats［J］．Meat Science，1996，43(Supplement 1):99 －109.

［19］ Gill C，Dussault R，Holley R A，et al.Evaluation of the hygienic performances of the processes for cleaning，dressing and cooling of pig carcasses in eight packing plants［J］．International Journal of Food Microbiology，2000，58(1/2):65－72.

［20］ Byun JS，Min JS.Comparison of indicators of microbial quality of meat during aerobic cold storage［J］．J Food Prot，2003，66(9):1 733 －1 737.

［21］ O＇Sullivan M G，Byrne D V，Martens，et al.Evaluation of pork colour:Prediction of visual sensory quality of meat from instrumental and computervision methods of colour analysis［J］．Meat Science，2003，65(2):909 － 918.