大鼠AQP7基因重組腺病毒載體的構建及其在3T3-L1脂肪細胞中的表達

潘偉，谷雪梅，沈飛霞

（溫州醫學院附屬第一醫院 內分泌科，浙江 溫州 325000）

大鼠AQP7基因重組腺病毒載體的構建及其在3T3-L1脂肪細胞中的表達

潘偉，谷雪梅，沈飛霞

（溫州醫學院附屬第一醫院 內分泌科，浙江 溫州 325000）

目的：構建攜帶大鼠AQP7基因的腺病毒載體，并檢測其在3T3-L1脂肪細胞中的表達。方法：采用RT-PCR方法，從大鼠脂肪組織中擴增克隆大鼠AQP7基因，插入到穿梭質粒中獲得重組質粒pDC316-AQP7。PCR、酶切鑒定后，重組穿梭質粒和骨架質粒經脂質體2000轉染293細胞出毒產生重組腺病毒。經PCR進行鑒定，轉染293細胞擴增并純化，半數組織培養感染劑量（TCID 50）方法測定腺病毒滴度。體外轉染分化成熟的3T3-L1細胞，用Western blot方法檢測AQP7的表達水平。結果：PCR、酶切及測序證實重組穿梭質粒構建正確。同時成功構建AQP7重組腺病毒，并制備出高滴度的病毒保存液，可以有效轉染3T3-L1細胞。結論：成功構建了含大鼠AQP7基因的重組腺病毒載體且其可以在3T3-L1細胞中有效表達，為今后更好地研究AQP7在肥胖發生發展過程中的調控機制奠定了基礎。

水通道蛋白7；重組腺病毒；3T3-L1細胞；大鼠

水通道蛋白7（AQP7）為近年來發現的肥胖相關基因，其在脂肪組織中大量分布，參與甘油轉運而影響脂肪代謝，與肥胖形成關系密切。多項研究[2-4]顯示，AQP7功能下降或缺失致使脂肪細胞中甘油堆積，進而促進甘油三酯的合成，引起糖脂代謝紊亂，最終可能導致肥胖和（或）2型糖尿病的發生。AQP7對甘油的運輸作用使人們對肥胖有了新的認識，從而對肥胖的研究進入一個嶄新的領域。通過選擇性增加脂肪細胞AQP7的表達，可望在肥胖治療方面發揮重要作用。正如文獻[5]報道給機體補充AQP1，可以有效治療干燥綜合征。

近來興起的基因治療為肥胖的防治提供了新的思路，但目前關于AQP7基因腺病毒載體的構建國內外亦鮮有報道。3T3-L1脂肪細胞是體外研究糖脂代謝和相關藥物作用機制的重要模型。既往研究顯示3T3-L1細胞表面腺病毒受體水平過低以致腺病毒轉染效率低下[6]，因此，本研究在體外條件下轉染AQP7基因重組腺病毒載體的時候加用多聚賴氨酸來增加腺病毒與3T3-L1細胞的黏附，進而觀察3T3-L1細胞中AQP7的表達，為進一步探討AQP7在肥胖發生、發展過程中的作用機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級雄性SD大鼠5只（200～250 g），購自溫州醫學院實驗動物中心；3T3-L1細胞購自中國科學院細胞庫；AdMax腺病毒包裝系統購自北京本元正陽基因有限公司；感受態DH5α由本實驗室自備；限制性內切酶購自New England Biolabs公司；T4 DNA連接酶購自MBI公司；脂肪組織RNA提取試劑盒購自QIGEN公司；逆轉錄試劑盒、DNA marker DL2000和DNA片段回收試劑盒購自Takara公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；PCR純化試劑盒購自V-gene公司；PCR引物合成及DNA序列分析由北京本元正陽基因技術有限公司完成；胰島素（INS）、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）、多聚賴氨酸購自Sigma公司；兔抗鼠AQP7多克隆抗體購自Abcam公司；β-actin抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗購自碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提?。喝⌒迈r大鼠內臟脂肪組織100 mg于液氮中反復碾磨成粉末樣，按試劑盒操作說明提取脂肪組織總RNA。

1.2.2 RT-PCR克隆AQP7基因：取1μg RNA按照逆轉錄試劑盒說明合成cDNA鏈，然后以此單鏈為模板進行PCR反應。根據GenBank中AQP7的核苷酸序列（NM_019157.2）設計引物：上游引物序列為5’- ACT TAGCGGCCGCATGGCCGGTTCTGTGCTGGAGAACATACA-3’（下劃線為NotI酶切位點），下游引物序列為5’-ACTTAAAGCTTCTAAGAACCCTGTGGTGGTATGCCGGCG-3’（下劃線為HidIII酶切位點）。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30次循環后72 ℃延伸5 min，擴增后產物對比DL2000明確目的條帶大小，按照膠回收試劑盒說明回收AQP7基因片段。

1.2.3 重組腺病毒pDC316-AQP7穿梭質粒的構建：pDC316質粒和AQP7基因分別經NotI和HindIII 37 ℃雙酶切3 h后，用凝膠提取試劑盒回收相應片段，在T4 DNA連接酶25 ℃室溫連接3 h。取5 μL連接產物熱休克法轉入感受態大腸桿菌DH-5α，接種到含有氨芐青霉素的LB平板上培養過夜，次日挑取白色陽性單克隆菌落搖菌，提取重組質粒pDC316-AQP7。重組質粒PCR擴增產物電泳鑒定，續用NotI和HindIII雙酶切，取8μL酶切產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳、鑒定。測序結果通過NCBI上BLAST比對分析。

1.2.4 雙質粒共轉染293細胞，同源重組產生重組腺病毒：轉染前一天，把293細胞接種到6孔板內，每孔5×105個細胞，培養基為含10% Hyclone胎牛血清的DMEM，37 ℃含5% CO2的培養箱中培養過夜。待細胞生長至底面積的80%～90%時進行轉染。轉染當天更換新鮮培養基，取骨架質粒pBHGlox_E1，3Cre和重組穿梭質粒pDC316-AQP7，按照Lipofectamine 2000脂質體說明書進行轉染。轉染次日將長滿的細胞傳代于25 cm2細胞培養瓶中，用含5%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養，每天觀察，待細胞長滿瓶底時，再傳入75 cm2細胞培養瓶中，每天觀察細胞出毒跡象。待細胞大部分病變并從底部脫落進行收毒。將出毒的細胞培養瓶先后置于-70 ℃冰箱和37 ℃水浴鍋中反復凍融三次，使病毒從病變細胞中充分釋放。將凍融液3000 r/min離心5 min，收集含病毒的上清液，棄沉淀。該上清即為第一代毒種（P1），作為隨后大量病毒擴增的毒種。

1.2.5 Ad5-AQP7病毒毒種鑒定：待25 cm2細胞瓶中培養的293細胞生長至90%時，取上述第一代毒種500μL接種。待細胞完全病變時按前述方法凍融3次，離心收集病毒上清液，此即為第二代毒種（P2）。取50μL P2毒種上清液，加入2μL蛋白酶K，56 ℃溫育，煮沸10 min，冰浴冷卻，取1μL作為模板，進行PCR鑒定。上游引物5’-TTCCACAATGG CCGGTTCTGT-3’，下游引物5’-TCCAATCTCTAAGAACCCT GT-3’，產物大小824 bp。以不攜帶目的基因片段的pDC316質粒轉染293細胞獲得的腺病毒粗提液為陰性對照。

1.2.6 Ad5-AQP7重組腺病毒生產和純化：病毒生產過程：在75 cm2方瓶中接種4×106293細胞，培養過夜，待細胞生長至90%，取2 mL P2代毒種接種培養瓶內，44 h后顯微鏡下觀察細胞完全病變。收獲病變細胞混懸液后反復凍融3次，離心取上清，按同樣方法接種于另外75 cm2方瓶中直至收獲足量病變細胞混懸液。

病毒純化方法：細胞混懸液3000 r/min離心10 min，棄上清，細胞沉淀用Tris緩沖液重懸，反復凍融3次，6000 r/min離心后取上清，用DNase酶消化后，經 0.45μm的濾膜過濾，然后進行柱純化。離子交換純化后，然后再用分子篩進一步純化，將純化后的病毒保存于腺病毒保存液中，經除鹽處理后用0.22μm一次性濾器過濾出菌，用從而得到無菌的純化病毒，保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.7 純化病毒的滴度測定：①用10×的病毒裂解液裂解純化病毒樣品，測定OD260和OD280值，計算每毫升制品中的病毒顆粒數（VP/mL）=OD260×1.1×1012。②參照LaBarre等[7]方法測定病毒制品的TCID 50值。

1.2.83 T3 -L1細胞的培養及誘導分化：3T3-L1前脂肪細胞用10%新生小牛血清的高糖DMEM培養基在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養，待細胞融合2 d后，加含有0.5 mmol/L IBMX、1μmol/L DEX和5μg/mL INS的10% FBS的DMEM培養48 h，更換含5μg/mL INS的培養基再培養48 h，隨后用10% FBS的DMEM培養基繼續培養，2 d換液一次，至細胞分化為成熟的脂肪細胞。

1.2.9 重組腺病毒Ad5-AQP7轉染3T3-L1細胞及Western blot法檢測蛋白表達：參考Orlicky等[6]的方法，在DMEM培養基中加入多聚賴氨酸溶液成終濃度0.5μg/mL，加入病毒液（MOI為300），室溫靜置100 min。PBS洗板2次后六孔板內每孔加入上述包含病毒溶液，37 ℃培養箱內放置1.5 h后每孔另加DMEM補足。24 h后更換為10% FBS的DMEM培養基。

培養72 h后吸棄培養基，用預冷PBS洗滌細胞2次后，每孔加入細胞裂解液100μL，刮起細胞，細胞懸液過27G針頭數次，冰上靜置30 min后12000 r/min 4 ℃離心20 min，吸取上清用BCA法測定蛋白濃度。蛋白置于-80 ℃冰箱保存。電泳前按4:1體積比與5×loading buffer 混合，100 ℃ 熱變性5 min。取50μg蛋白上樣12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫搖床封閉1 h，一抗AQP7（1:500）或β-actin（1:3000）4 ℃孵育過夜，次日與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h后，加ECL試劑反應，顯像，成像。

2 結果

2.1 AQP7 cDNA PCR結果 PCR產物經電泳后在750～1000 bp之間有條帶明顯，與預先設計的AQP7 DNA長度相符，而陰性對照未見擴增條帶（見圖1）。

2.2 重組質粒pDC316-AQP7鑒定

2.2.1 重組質粒PCR鑒定：重組pDC316-AQP7質粒擴增后電泳，出現810 bp大小條帶，陽性質粒構建成功（見圖2）。

圖2 pDC316-AQP7質粒PCR鑒定

圖3 重組pDC316-AQP7質粒雙酶切鑒定

2.2.2 雙酶切鑒定：經NotI+HindIII雙酶切后凝膠電泳觀察到5.8 kb和810 bp大小2個片段，與預期結果相符，該質粒經酶切鑒定正確（見圖3）。

2.2.3 測序鑒定：經測序比對分析，其核酸序列與GeneBank中AQP7的mRNA編碼序列（NM_019157.2）同源性完全一致。

2.3 重組腺病毒Ad5-AQP7的包裝和鑒定

2.3.1 重組腺病毒包裝：雙質粒共轉染293細胞8 d后出現細胞病變效應，表現為細胞變大變圓，呈葡萄狀，并開始出現明顯噬斑（見圖4）。

圖4293 細胞出毒現象（×200）

2.3.2 Ad5-AQP7毒種PCR鑒定：提取P2病毒毒種的DNA進行PCR，同時用pDC316-AQP7質粒作為陽性對照，可以擴增出824 bp大小的基因片段，證實該重組病毒含有目的基因，而作為陰性對照的不攜帶AQP7基因的空載腺病毒沒有擴增條帶（見圖5）。

圖5 Ad5-AQP7毒種PCR鑒定

2.3.3 Ad5-AQP7病毒滴度測定：檢測結果顯示重組腺病毒顆粒數為7.36×1011VP/mL，TCID50免疫法測得感染滴度為1.58×1010IU/mL，分裝凍存以備后續實驗。

2.4 重組腺病毒在3T3-L1細胞中的表達 分化成熟的3T3-L1脂肪細胞中可見AQP7的表達，轉染Ad5-AQP7重組腺病毒后其含量明顯升高（P＜0.01）（見圖 6）。

1.分化成熟3T3-L1脂肪細胞；2.轉染空載腺病毒；3.轉染Ad5-AQP7與1組比：aP<0.01

3 討論

自1988年Agre等在鑒定人類Rh血型抗原時偶然發現了一種紅細胞膜上的新28 ku 蛋白，即后來被命名的AQP1以來，至今在哺乳動物中已發現13種水通道蛋白（AQP 0～12）。這些AQPs在通透水的功能上有著相似之處，但由于表達部位及含量的不同，又發揮著各自特異的生理功能。AQP7作為其中一員，除了可以運輸水分子之外，還可以運輸甘油、尿素等小分子物質，此基因最早從人的脂肪細胞中克隆成功，由于其mRNA水平在脂肪組織中表達豐富，故又被命名為脂肪水通道蛋白（aquaporin adipose，AQPap）。在體外培養發現隨著3T3-L1細胞分化進程，AQP7 mRNA水平表達逐漸上升，并且培養基中甘油濃度也平行增加，這種效應可以被水通道蛋白的非特異性拮抗劑汞離子所阻滯，表明AQP7主要介導脂肪動員產生的甘油輸出過程[8]。Hibuse等[3]用RNAi敲除AQP7的3T3-L1細胞發現，胞內甘油含量上升，油酸攝取增加，甘油激酶活性提高，從而促進甘油三酯的合成導致細胞內甘油三酯的蓄積促成脂肪細胞的肥大。這些結果顯示AQP7在調控脂肪代謝方面起著關鍵的媒介作用，與肥胖的形成關系密切。

基因治療是當今醫學研究中最具前景的研究之一，而腺病毒載體是近年來發展起來的基因運載系統。其優點突出，對分裂和非分裂細胞均可以轉染，感染能力強，外源基因容量大，不整合到宿主基因組，此外，相比慢病毒、逆轉錄病毒還具有病毒滴度高，易于操作等優點[9]。本實驗選用AdMax腺病毒包裝系統，通過Cre/loxP獲得重組病毒，這個過程發生在293細胞中，從而避免在細菌中重組，操作簡便、重組效率高以及可以獲得較高的病毒產率。本實驗通過此腺病毒包裝系統，獲得高純度、高滴度的Ad5-AQP7重組腺病毒，經過鑒定構建成功，足夠滿足后續的細胞和動物要求。

3T3 -L1細胞系是3T3的一個亞型，有自發分化為脂肪細胞的特性，但自發分化率較低。加入具有促成脂作用的誘導劑后，大部分細胞可以分化為成熟脂肪細胞。與Orlicky等[6]研究結果一致，通過多聚賴氨酸可增加腺病毒與3T3-L1細胞的黏附力并且在細胞中高效穩定表達，實驗結果證實重組腺病毒在3T3-L1細胞中得到表達。本研究成功構建大鼠AQP7重組腺病毒，并穩定轉染3T3-L1細胞，為進一步研究AQP7與脂肪代謝的相關性奠定了良好實驗基礎，并對疾病的基因治療有一定的指導意義。

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Construction of rat AQP7 recombinant adenovirus vector and its expression in 3T3-L1 cells

PAN Wei，GU Xuemei，SHEN Feixia.Department of Endocrinology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325000

Objective:To construct the recombinant adenovius vector carrying rat AQP7 and transfect the 3T3-L1 cells.Methods:The full cDNA sequence was obtained from rat adipose tissue using RT-PCR. The AQP7 gene was inserted into pDC316 shuttle plasid in order to produce recombinant pDC316-AQP7. After the identification of PCR，restriction endonuclease digestion and sequencing，the recombinant pDC316-AQP7 shuttle plasid coinfected with rescue plasmid into 293 cells by Lipofectamine 2000. The recombinant adenovirus vector(Ad5-AQP7)was confirmed by PCR，and then amplified in 293 cells and purified. The titer was used 50% tissue culture infective dose(TCID)assay. 3T3-L1 cells were transfected with Ad5-AQP7 and the expression of AQP7 gene was detected with Western blot.Results:PCR，restrition endonuclease digestion and sequencing analysis confirmed the construction of pDC316-AQP7 shuttle plasmid.Recombinant adenovius with high titer was produced and could express efficiently in 3T3-L1 cells.Conclusion:Recombinant adenovirus vector carring rat AQP7 gene(Ad5-AQP7)is success-fully constructed and can be expressed in 3T3-L1 cells，which may provide a potent tool to investigate the function of AQP7 during the development of obesity.

AQP7；adenovirus；3T3-L1 cells；rats

Q784

A

1000-2138（2012）06-0521-05

2012-01-26

浙江省自然科學基金資助項目（Y2080418）。

潘偉（1985-），女，浙江溫州人，碩士生。

沈飛霞，主任醫師，碩士生導師，Email：sfx 301@163.com。

丁敏嬌）

·臨床經驗·