IVF-ET術后流產患者絨毛和蛻膜組織凋亡及相關調控蛋白的表達

張先霞，王繁

（溫州醫學院，浙江 溫州 325035，1.第二臨床醫學院；2附屬第二醫院 婦產科）

IVF-ET術后流產患者絨毛和蛻膜組織凋亡及相關調控蛋白的表達

張先霞1，王繁2

（溫州醫學院，浙江 溫州 325035，1.第二臨床醫學院；2附屬第二醫院 婦產科）

目的：檢測體外受精-胚胎移植（IVF-ET）術后早期自然流產患者絨毛和蛻膜組織凋亡及相關調控蛋白血管內皮生長因子（VEGF）、Bcl-2的表達，探討其發病和基因調控機制。方法：采用免疫組織化學染色技術檢測IVF-ET術后早期自然流產者（IVF-ET組）絨毛及蛻膜組織Bcl-2、VEGF的表達水平，并以同期正常早孕者（正常早孕組）的標本為對照。結果：VEGF主要表達于絨毛滋養細胞和血管內皮細胞胞漿。IVF-ET組VEGF表達明顯低于正常早孕組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。Bcl-2主要在絨毛合體滋養細胞上表達。IVF-ET組滋養細胞及蛻膜細胞染色較淺，表達呈弱陽性，正常早孕組染色較深，表達強陽性，差異有統計學意義（P＜O.05）。結論：IVF-ET術后早期自然流產者絨毛及蛻膜組織中VEGF及Bcl-2表達顯著降低，提示早期妊娠中VEGF及Bcl-2的低表達可能是導致IVF-ET術后早期自然流產的原因之一。

血管內皮生長因子；Bcl-2；絨毛膜絨毛；蛻膜；體外受精-胚胎移植術；流產，自然

體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）作為人類輔助生殖中的重要技術，已成為不孕不育癥的理想治療措施之一。盡管IVF-ET技術水平逐漸提高，其分娩率目前仍只為22.8%～47.8%[1]，而自然妊娠后的分娩率為80%～90%[2]，因此對IVF-ET術后高流產率的研究具有重要的臨床意義。目前國內有少量關于自然流產者絨毛及蛻膜組織中細胞周期和凋亡的研究報道，但IVF-ET術后自然流產患者絨毛及蛻膜組織中細胞凋亡及相關調控蛋白的表達情況國內外鮮見報道。我們通過常規組織切片及免疫組織化學染色觀察IVF-ET術后自然流產及正常早孕者絨毛及蛻膜組織結構的形態學變化，檢測和分析凋亡及相關調控蛋白血管內皮生長因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）、Bcl-2的表達差異，探討IVF-ET術后自然流產的發病和基因調控機制。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 IVF-ET組：選取2010年6月至2011年9月在溫州醫學院附屬第二醫院婦產科實施IVF-ET助孕術后無明顯誘因出現自然流產的患者30例，年齡25～40歲，平均（28.92±3.23）歲，孕4～9周，平均（7.42±1.39）周。B超提示胚囊未見胚芽或未見原始心管搏動而確認為胚胎停育。流產后取絨毛及蛻膜組織。

1.1.2 正常早孕組： 選擇同期自愿實施人工流產術的女性30例，年齡20～35歲，平均（27.07±3.91）歲，孕4～10周，平均（7.17 4±1.23）周。B超證實為宮內妊娠且符合孕周，可見胚芽及原始心管搏動。流產術后取絨毛及蛻膜組織。

所有研究對象均身體健康，無自身免疫、內分泌疾病，無生殖系統畸形、腫瘤和感染。月經規律（月經周期為28～30 d），3個月內未服用甾體類藥物及抗早孕藥物，未放置宮內節育器。同時男方精液正常，夫婦染色體核型正常。兩組間年齡、孕周以及以往流產次數進行比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標本采集與處理：高壓消毒并用焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理收集標本所需的器皿及工具，于吸宮術后找出絨毛及蛻膜組織各5 g（約 2.0 cm×2.0 cm大小），用4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液洗凈。標本置10%中性甲醛液中固定。送實驗室取材石蠟包埋切片，常規染色病理組織學觀察。

1.2.2 免疫組織化學染色：鼠抗人VEGF單克隆抗體和鼠抗人Bcl-2單克隆抗體工作液購自福建邁新和北京中杉生物公司。采用免疫組織化學技術Envision二步法，實驗步驟按試劑盒說明書進行，最后經DAB顯色，蘇木素復染。用已知陽性片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結果判定 由2名病理科醫師獨立觀察切片中10個高倍視野（×400）。

Bcl-2陽性標準：Bcl-2定位于胞漿和胞膜內，表達陽性信號為棕黃色。根據顯色程度分為4級：＜10%或無著色為（-）；10%～25%，淡黃色為（+）；25%～40%，棕黃色為（++）；＞40%，棕褐色為（+++）。

VEGF陽性標準：VEGF定位于胞漿，表達陽性信號為棕黃色。按陽性細胞占總細胞的百分比分為4級：＜5%為陰性（-）；5%～25%為陽性（+）；25%～50%為中度陽性（++）；＞50%為強陽性（+++）。陽性率統計以（++）及以上為標準。

1.4 統計學處理方法 統計軟件采用SPSS11.0軟件包。率的比較用x2檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 病理組織學觀察 IVF-ET組：絨毛結構完整，少數絨毛水腫，部分絨毛間質輕度黏液變，部分見中央水池樣改變，合體滋養細胞及細胞滋養細胞增生不明顯；內膜腺體部分見分泌反應，腺體中度擴張，細胞單層排列，立方形或低柱狀，未見明顯AS現象；蛻膜細胞發育不完全，細胞質少，細胞平鋪但嵌合不良，部分細胞核不規則；間質炎性細胞浸潤較多，血管擴張充血。

正常早孕組：絨毛結構完整，少數絨毛水腫，間質輕度黏液變，未見中央水池樣改變，合體滋養細胞及細胞滋養細胞明顯增生，以細胞滋養細胞為主；內膜腺體擴大彎曲，腺腔擴張，內有分泌物，腺上皮細胞透亮，胞質豐富，呈簇狀突起，A-S反應明顯；蛻膜細胞肥碩，細胞平鋪，胞質豐富，相互嵌緊呈磚砌狀排列，核卵圓形，居中；間質炎性細胞少量浸潤，血管擴張充血。

2.2 VEGF在絨毛及蛻膜組織中的表達與分布 VEGF主要表達于細胞胞漿中。在IVF-ET組：合體滋養細胞與部分細胞滋養細胞均可見表達，陽性率為67%；絨毛間質細胞和血管內皮細胞表達顯著，幾乎全部表達；蛻膜細胞部分表達，淺表層蛻膜細胞陽性較明顯，底層表達弱陽性。在正常早孕組：合體滋養細胞和細胞滋養細胞陽性表達率高，達90%，個別細胞滋養細胞未見表達，染色程度較IVF-ET組強；絨毛間質細胞和血管內皮細胞均見強陽性表達；蛻膜細胞全層表達，染色強度深淺不一；腺體也表達。見圖1-4。IVF-ET組與正常早孕組比較，差異有統計學意義（P＜O.05），見表1。

圖1 VEGF在IVF-ET組絨毛中的表達（×200）

圖2 VEGF在正常早孕組絨毛中的表達（×200）

圖3 VEGF在IVF-ET組蛻膜中的表達（×200）

圖4 VEGF在正常早孕組蛻膜中的表達（×200）

表1 VEGF在兩組絨毛及蛻膜組織中的表達（n=30）

2.3 Bcl-2在絨毛與蛻膜組織中的表達與分布 Bcl-2主要在絨毛及蛻膜細胞胞漿及胞膜上表達。兩組均有明確表達。IVF-ET組：多表達在絨毛外圍合體滋養細胞，圍繞絨毛表達，細胞滋養細胞染色淺或不著色，表達弱陽性；蛻膜細胞表達弱陽性（見圖5-6）。正常早孕組：表達部位與IVF-ET組相同，但滋養細胞和蛻膜細胞染色深，表達強陽性（見圖7-8）。IVF-ET組與正常早孕組比較，差異有統計學意義（P＜O.05），見表2。

圖5 Bcl-2在IVF-ET組絨毛中的表達（×200）

圖6 Bcl-2在IVF-ET組蛻膜中的表達（×200）

圖7 Bcl-2在正常早孕組絨毛中的表達（×200）

圖8 Bcl-2在正常早孕組蛻膜中的表達（×200）

表2 Bcl-2在兩組絨毛與蛻膜組織中的表達（n=30）

3 討論

3.1 絨毛及蛻膜細胞組織學改變 為更好地適應胎兒的需要，胎盤通過蛻膜細胞及滋養層細胞的增殖與凋亡不斷進行組織結構的改建，以達到相對穩定狀態維持妊娠。合體細胞的凋亡增加可能影響胎盤的功能，抑制血管的發生，引起供血不足。蛻膜提供胚胎發育以營養支持， 來保護胚胎不受母親的免疫反應并調整滋養層侵入子宮基質的深度[3]。若這種平衡狀態被打破，將導致自然流產的發生。本研究比較了IVF-ET術后流產者與正常早孕者絨毛及蛻膜組織的病理組織學改變，發現兩組間絨毛及蛻膜細胞結構及形態有明顯不同。在IVF-ET組中絨毛滋養細胞增生不明顯，腺體小，分泌反應低；蛻膜細胞發育不完全，細胞間嵌合不良。而正常早孕組，絨毛滋養細胞增生明顯，腺體高度分泌反應，A-S現象多見；蛻膜細胞肥碩，細胞嵌合緊密。提示IVFET術后流產者可能存在某些機制，導致絨毛及蛻膜細胞結構及形態改變，細胞發育障礙，最終導致流產的發生。

3.2 VEGF在IVF-ET術后流產患者絨毛及蛻膜組織中表達下降的意義 VEGF和血管內皮細胞的特異性受體結合，具有強大的促內皮增殖、促血管生成作用。Hickey等[4]指出，血管生成對于人類子宮內膜的增殖和分化、胚胎植入以及妊娠維持十分重要。VEGF在受精卵著床過程中發揮重要作用，并參與整個妊娠期間胎盤生長過程的血管形成，妊娠婦女血中VEGF水平較非妊娠婦女有明顯的升高，且孕中期時達到高峰。因此血管的新生和血管化是構建蛻膜毛細血管網以及胚胎生長發育的基礎。VEGF單一等位基因的丟失或變異可導致胚胎在發育早期因血管異常而死亡[5]。Al-Khateeb等[6]研究173例早期習慣性流產患者發現，與正常早孕婦女相比，習慣性流產患者血清VEGF濃度明顯降低，說明VEGF表達下降使血管生成障礙，最終導致胚胎難以植入。Sherer等[7]和Kaloglu等[8]的動物實驗也證明了這一點。

本研究通過檢測IVF-ET術后早期流產者和正常早孕者絨毛及蛻膜組織中VEGF的相對表達量的差異，探討VEGF表達情況與妊娠失敗的關系。結果顯示，VEGF在正常早孕者的蛻膜及絨毛組織中表達量相對較高，而在IVF-ET術后早期流產者的絨毛及蛻膜中表達量較低。這說明一定水平的VEGF的表達對妊娠的維持具有保護作用，而在妊娠早期滋養細胞向子宮肌層侵入的關鍵時期，VEGF表達下降可能導致滋養細胞血管化不足，細胞過度凋亡而發生不可避免流產。因此，我們認為在保胎治療中，先兆流產婦女補充外源性VEGF可能有利于維持妊娠，減少流產的發生。

3.3 Bcl-2與細胞凋亡 Bcl-2是Bcl-2基因家族中重要的細胞凋亡抑制基因，其功能主要是抑制細胞凋亡，延長細胞壽命，而不影響細胞周期和分化。Bcl-2蛋白家族是調節凋亡的中心，對組織正常的生長和細胞的動態平衡有著關鍵的作用[9]。對正常凋亡信號反應的改變是癌癥的標志，故以往對Bcl-2蛋白的研究多集中在癌癥方面。而妊娠早期，胚胎植入后，滋養層侵襲子宮內膜，這個侵襲的過程類似腫瘤侵潤性生長的過程。我們研究發現，Bcl-2主要在早期絨毛合體滋養細胞及蛻膜細胞胞漿及胞膜上表達，而在細胞滋養細胞表達較低。分析原因可能為合體滋養細胞作為執行功能的分化終末細胞，凋亡的發生是其必然結局，故其量較細胞滋養細胞高。在IVF-ET組絨毛染色淺或不著色，蛻膜細胞表達弱陽性，而正常早孕組合體滋養細胞和蛻膜細胞染色均較深，表達呈強陽性，IVF-ET組陽性率明顯低于正常早孕組，提示Bcl-2在抑制合體滋養細胞凋亡方面發揮重要作用，Bcl-2表達下降引起合體滋養細胞凋亡增加，所致胎盤屏障通透性的增加可能在流產的發生中發揮了重要的作用。

綜上所述，VEGF表達異常，導致IVF-ET術后胎盤的血管發育不良供血不足，Bcl-2表達下降，導致細胞凋亡失衡，影響滋養細胞分化、浸潤，以上兩者最終影響胎兒和（或）胎盤的發育，導致流產的發生。至于兩者之間的相關性，有待進一步研究。

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Human chorionic villi and deciduas apoptosis and related modulin expression of IVF-ET failure

ZHANG Xianxia*，WANG Fan.*The Second Clinical Medical Institute of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective:To investigate the human chorionic villi and deciduas apoptosis and related regulatory protein(VEGF，Bcl-2)expression in early spontaneous abortion after treatment of in vitro fertilization-embryo transfer(IVF-ET)and explore the pathomechanism of spontaneous abortion.Methods:The expression of VEGF and Bcl-2 in the chorionic villi and deciduas was detected and analyzed in 30 cases of early spontaneous abortion patients after in vitro fertilization-embryo transfer(IVF-ET)through immunohistochemisty method，Thirty cases of normal early pregnancy as control.Results:Immunohistochemistry displayed that VEGF mainly expressed in cytoplasm of villi trophocyte and vascular endothelial cell. The VEGF level of early spontaneous abortion after IVF-ET group was significantly lower than that of normal early pregnancy group(P＜0.05). Bcl-2 mainly expressed in the villi syncytiotrophoblast.Trophoblasts and decidual staining were shallow and weakly positive in early spontaneous abortion after IVF-ET group. But trophoblasts and decidual of normal early pregnancy group were deeply stained，the expression was strong positive. Difference between two groups was significant(P＜0.05).Conclusion:The expression of VEGF and Bcl-2 decreases significantly in both chorionic villi and deciduas of early spontaneous abortion after IVF-ET. We speculate that the reduction of the expression of VEGF and Bcl-2 in the deciduas and chorionic villi in early gestation stage may cause abortion.

VEGF；Bcl-2；chorionic villi；deciduas；IVF-ET；abortion，spontaneous

R71

A

1000-2138（2012）06-0545-04

2012-05-15

浙江省大學生科技創新活動計劃（新苗人才計劃）項目（2010R413028）。

張先霞（1988-），女，浙江新昌人，本科生。

王繁，副主任醫師，Email：wangfan7510@sohu.com。

丁敏嬌）

·論 著·