熄風膠囊對氯化鋰－匹羅卡品癲癇大鼠反復自發性發作及海馬損傷的干預作用

李新民， 秦潞平， 路巖莉

熄風膠囊對氯化鋰－匹羅卡品癲癇大鼠反復自發性發作及海馬損傷的干預作用

李新民， 秦潞平， 路巖莉

目的 觀察中藥熄風膠囊單藥和聯合用藥干預治療對氯化鋰－匹羅卡品癲癇大鼠反復自發性發作及海馬損傷的影響。方法 將SPF級健康雄性Wistar大鼠160只隨機分為正常組、模型組、熄風膠囊高劑量干預組（熄高組）、熄風膠囊中劑量干預組（熄中組）、熄風膠囊低劑量干預組（熄低組）、熄風膠囊大劑量＋托吡酯聯合干預組（聯高組）、熄風膠囊大劑量＋托吡酯1／2劑量聯合干預組（聯低組）、托吡酯干預組（TPM組）各20只。運用氯化鋰－匹羅卡品化學點燃法，復制癲癇大鼠模型，觀察熄風膠囊單藥和聯合用藥干預治療對大鼠反復自發性發作（SRS）的影響；通過常規病理及電鏡觀察海馬結構形態學改變，應用Timm組織化學染色法進行海馬苔蘚纖維出芽（MFS）的觀察。結果 （1）所有干預組大鼠癇樣發作平均級別均低于模型組而高于正常組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（2）各干預組誘發癲癇持續狀態的大鼠SRS發作次數均高于正常組而低于模型組，差異均有統計學意義（P＜0.01），其中熄高組SRS次數低于熄中組、TPM組、熄低組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；聯髙組SRS次數低于熄低組，差異有統計學意義（P＜0.01）。（3）Timm染色結果顯示：所有干預組海馬CA3始層及齒狀回分子層Timm染色顆粒MFS總面積低于模型組，差異均有統計學意義（P＜0.05），其中在CA3區熄高組、聯髙組、聯低組與模型組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。（4）光、電鏡結果顯示：各干預組中聯低組海馬結構損傷最輕，熄高組海馬結構損傷較熄中組、熄低組輕。結論 熄風膠囊單藥及與TPM聯合用藥可以有效地減低氯化鋰－匹羅卡品癲癇大鼠的SRS，減輕海馬損傷，抑制MFS。

癲癇／中醫藥療法； 熄風膠囊／治療應用； 大鼠； 動物，實驗

熄風膠囊為馬融教授根據“益腎填精，豁痰熄風”法則所研制。既往本課題組的實驗研究表明，該藥能下調戊四唑所致驚厥小鼠腦內c－fos的表達，降低神經元的興奮性，并可通過促進小鼠腦內一氧化氮合酶的活性及表達，促進一氧化氮的釋放，減輕戊四唑誘發驚厥后所出現的DNA、RNA改變，減少癲癇后所致腦損傷，發揮神經保護作用［1］。臨床實踐已證實熄風膠囊對小兒癲癇強直－陣攣性發作安全、有效［2］。本研究旨在利用氯化鋰－匹羅卡品癲癇動物模型，觀察熄風膠囊單藥和聯合用藥治療對該病造模大鼠反復自發性發作（spontaneous recurrent seizures，SRS）及海馬損傷的干預作用，探討中藥、中西藥聯合治療難治性癲癇的作用特點及作用機制，進一步為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性Wistar大鼠160只，體質量（200±10）g，購自解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心（動物合格證號：SCXK－（軍）2007－004），適應性喂養1周后開始實驗。

1.2 實驗藥品 鹽酸匹羅卡品、氯化鋰（美國Sigma公司），托吡酯（西安楊森公司），研缽研碎成細粉末后配成藥液濃度為2g／L；熄風膠囊（天津中醫藥大學第一附屬醫院杏林藥廠），按高、中、低給藥劑量用雙蒸水配成，濃度分別為0.99、0.66、0.33g／mL。

1.3 實驗器材 取材用開胸、取腦手術器械一套、恒溫水浴箱江蘇教學儀器廠、半自動切片機、超聲機、冰凍切片機、光學顯微鏡、數碼照相機、紅外線攝像頭4個、四路視頻采集卡、OLYMPUS－BX40生物顯微鏡、HMIAS－2000高清晰度彩色病理圖像分析系統、Leica超薄切片機、日立H－7500型透射電子顯微鏡。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 將160只大鼠按隨機數字表法分成8組，即正常組、模型組、熄風膠囊高劑量干預組（熄高組）、熄風膠囊中劑量干預組（熄中組）、熄風膠囊低劑量干預組（熄低組）、熄風膠囊大劑量＋托吡酯聯合干預組（聯高組）、熄風膠囊大劑量＋托吡酯1／2劑量聯合干預組（聯低組）、托吡酯干預組（TPM組）。每組各20只大鼠。

1.4.2 模型制作 造模前，熄高組、熄中組、熄低組分別灌胃給予相應濃度的熄風膠囊藥液2mL；聯高組、聯低組在灌胃給予高劑量熄風膠囊藥液基礎上，分別給予 TPM 20、10mg／kg；TPM 組灌胃給予TPM 20mg／kg；模型組和正常組：分別灌胃給予生理鹽水2mL。每日1次，連續灌胃1周，第8天開始給予造模。并觀察各組造模結果。除正常組20只，其余7組大鼠全部用于模型的復制。采用氯化鋰按3mmol／kg（濃度1.5mol／L）劑量腹腔注射，18～20h后腹腔注射硫酸阿托品1mg／kg以減少外周膽堿能作用，30min后腹腔注射鹽酸匹羅卡品按30mg／kg（濃度1%）注射，共注射1次，出現癲癇持續狀態（status epilepticus，SE）的大鼠，待SE持續60～90min后，再給予地西泮10mg／kg腹腔注射解除抽搐，如不能緩解癇性發作，可重復注射地西泮1～2次，直到癇性發作被解除。均正常喂養，所有實驗大鼠在4個紅外攝像頭下集中觀察60d。

1.4.3 模型評價 驚厥評分采用Racine分級標準［3］。

1.5 觀察指標

1.5.1 行為學評估 急性期觀察各種大鼠異常行為及癇性發作程度；發作程度參照Racine分級標準。慢性期記錄各組癲癇大鼠SRS次數。

1.5.2 Timm組織化學染色標本的制備 開顱取腦，置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（PBS）中24h。置于30%蔗糖溶液中，直至組織塊沉底。冰凍切片機切片，片厚20μm。經過上述處理得到的厚冰凍切片晾干。暗室中將晾干切片浸入新鮮配制的孵育液中（10%阿拉伯膠60mL，檸檬酸緩沖液10mL，5.67%對苯二酚30mL，2%硝酸銀2mL），恒溫水浴箱孵育30～60min。移出孵育液后，在暗處將切片用蒸餾水洗5min，移出暗處后再用蒸餾水洗10min。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

每只實驗動物選4張腦片，每組2只，在HMISA－2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統分別測海馬CA3及齒狀回苔蘚纖維出芽（MFS）的總面積。每組于400倍高倍鏡下隨機選取10個視域，用HMIAS－2000高清晰度彩色病理圖像分析系統進行定量分析。以0.207μm像素點長，在1.825 6×104μm2測量窗下，測量棕黃色反應物信號的總面積、面積百分比的相對水平。

1.5.3 電鏡標本的制備 以250mL含4%冷戊二醛的0.1mol／L PBS代替4%多聚甲醛0.1mol／L PBS進行內固定，直至肝臟、四肢、尾變硬。剝取海馬后，將樣品切成小于1mm×1mm×1mm的小塊，放入4%戊二醛中前固定，用PBS充分清洗后，放入1%鋨酸中后固定，再用PBS充分清洗，酒精梯度脫水，每次10～15min，再行100%丙酮脫水兩次，每次10～15min，環氧樹脂812、815混合物包埋、聚合后，用Leica超薄切片機切片，厚度為50nm，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色，日立H－7500型透射電子顯微鏡觀察、照相，加速電壓80kV。

1.5.4 光鏡標本的制備 10%水合氯醛0.3g／kg深度麻醉后，開胸暴露心臟，用改良后的50mL注射器針頭從心尖處刺入左心室到達升主動脈，切開右心耳。生理鹽水500mL加肝素鈉12 500U快速滴注，直至肝臟變色，右心耳流出無色透明液體。再灌注4%冷多聚甲醛0.1mol／L PBS約250mL進行內固定直至肝臟、四肢、尾變硬。然后取含海馬結構的2～3mm厚腦塊（冠狀切面），4%多聚甲醛液固定，石蠟包埋，常規光鏡制片，片厚3μm，HE染色。光鏡下觀察海馬結構形態學改變。

1.6 統計學方法 采用SPSS 12.0軟件對實驗數據進行統計學處理。計量資料采用±s表示，多組比較用單因素方差分析（one－way ANOVA），不同組別兩兩比較用q檢驗；計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗大鼠癇性發作情況

2.1.1 急性期 模型組平均發作級別為Ⅳ級；熄中組、熄低組和TPM組發作級別為Ⅲ級；熄高組、聯髙組和聯低組發作級別為Ⅱ級，見表1。

表1 造模后大鼠癲癇發作程度分析（±s，n＝20）

表1 造模后大鼠癲癇發作程度分析（±s，n＝20）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05；與熄高組比較，cP＜0.05；與聯髙組比較，dP＜0.05。

組別 發作級別正常組0模型組 4.20±1.28ac熄高組 2.60±1.64ab熄中組 3.20±1.20abd熄低組 3.45±1.10abcd聯髙組 2.40±1.43ab聯低組 2.45±1.47ab TPM 組 3.30±0.87abd

表1可見，所有藥物干預組大鼠造模后發作級別均低于模型對照組高于正常組（P＜0.05）；其中熄高組發作級別低于熄低組，聯髙組發作級別明顯低于熄中組、熄低組（P＜0.05）。

2.1.2 靜止期 模型組4只大鼠分別于造模后第3、4、6天相繼死亡，各干預組SE大鼠未見死亡。各組發作未達SE的大鼠活動正常。此期持續2～15d，各組持續時間差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.1.3 慢性期 各造模組于急性期誘發癲癇持續狀態的所有大鼠，在慢性期均出現SRS，見表2。

表2 熄風膠囊干預治療對造模大鼠SRS的影響（±s）

表2 熄風膠囊干預治療對造模大鼠SRS的影響（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05；與熄高組比較，cP＜0.05；與聯髙組比較，dP＜0.05。

組別 n SRS 20 0模型組 13 22.31±2.69a熄高組 7 5.57±1.51ab熄中組 9 7.78±1.56abc熄低組 14 13.64±2.90abd聯髙組 5 5.20±1.30ab聯低組 7 5.14±1.95ab TPM 組 8 7.88±1.13正常組abc次數

表2可見，模型組SE大鼠SRS次數最多，各干預組SE大鼠SRS發作次數均高于正常組而低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.01），其中熄高組明顯低于熄中組、TPM組、熄低組，差異有統計學意義（P＜0.05），聯髙組顯著低于熄低組，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 熄風膠囊干預治療對造模大鼠海馬苔蘚纖維出芽（mossy fiber sprouting，MFS）的影響 見表3。各干預組及模型組出現癲癇持續狀態的癲癇大鼠海馬CA3始層及齒狀回分子層皆可見染色顆粒明顯增多，呈點片狀及帶狀分布，見圖1（封三）。

表3 熄風膠囊干預治療對造模大鼠MFS的影響（±s，n＝5）

表3 熄風膠囊干預治療對造模大鼠MFS的影響（±s，n＝5）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05；與熄高組比較，cP＜0.05；與聯合治療組比較，dP＜0.05。

組別MFS的總面積CA3區118.17±86.62 33.33±49.36模型組 1 441.25±540.01abc 829.60±344.22ab熄高組 312.59±121.52b 303.08±119.68ab熄中組 520.22±127.84abcd 361.14±137.66ab熄低組 564.66±325.59abcd 400.45±198.44ab聯高組 320.86±93.92b 240.14±116.16ab聯低組 262.56±81.11b 288.95±144.13ab TPM 組 573.27±299.75abcd 342.32±100.42齒狀回正常組ab

表3可見，所有干預組海馬CA3始層及齒狀回分子層Timm染色顆粒MFS總面積低于模型組（P＜0.05）。在海馬CA3區，熄高組的作用優于中劑量、低劑量和TPM組（P＜0.05），聯合治療組的作用優于熄中組、熄低組和TPM組（P＜0.05）。熄高組、聯髙組、聯低組在CA3區、齒狀回分子層，3者差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 熄風膠囊干預治療對造模大鼠海馬結構形態學的影響 光鏡結果見圖2（封三），其中正常組CA1，CA3可見正常的神經元，齒狀回門區可見顆粒細胞排列整齊。模型組CA1區和CA3區及齒狀回可見許多神經元發生變性、壞死。變性的神經元腫脹，體積增大，核固縮。壞死的神經元胞質濃縮、深染，核碎裂。熄高組CA1區細胞變性不明顯，CA3區偶見細胞核固縮，變性，大多數細胞核清晰。齒狀回顆粒細胞排列整齊，偶見細胞核固縮、變性。熄中組CA1區可見核固縮散在，CA3區大多細胞核清晰，齒狀回可見核固縮，細胞排列欠整齊。熄低組CA1區可見細胞萎縮，偶可見神經元發生變性和固縮核，CA3區可見較多固縮核，細胞排列不整齊，齒狀回區可見神經元核固縮、壞死。聯高組CA1區和CA3區及齒狀回細胞形態較好，偶見神經元變性、核固縮。聯低組CA1區和CA3區及齒狀回細胞形態較好，較少見神經元變性、核固縮。TPM組CA1區細胞層數2～3層，可見變性細胞核，CA3區細胞減少，齒狀回可見核固縮、變性，細胞周圍水腫。

2.4 熄風膠囊干預治療對造模大鼠海馬超微結構損傷的影響 電鏡結果顯示：正常組神經細胞結構基本正常。模型組組織明顯損傷。熄高組細胞質和核質輕度水腫，細胞器胞質內可見大量內質網呈輕度擴張。熄中組細胞質和核質輕中度水腫，細胞器的數量減少，胞質內空化。熄低組細胞質和核質中度水腫，細胞器的數量明顯減少，胞質空泡化。聯高組接近正常神經元。聯低組接近正常神經元。TPM組細胞質和核質中度水腫，見圖3（封三）。

3 討論

馬融教授根據“益腎填精，豁痰熄風”法則，研制出熄風膠囊，方中紫河車味甘、咸、溫，為君藥，益腎填精，補腦益智，以達治癇之本；天麻平肝潛陽、熄風止痙，其辛潤不燥，為風中之潤劑，治風之妙藥，且其尚具祛痰之功，兼具熄風豁痰之長，為治癇之要藥；更配以石菖蒲之辛香避穢、豁痰開竅以達治癇之標，共為臣藥。方中借全蝎、僵蠶熄風止痙，白金丸行氣豁痰，共為佐使藥，以助豁痰熄風之力。因痰有聚散，風有動靜，導致癇證作止無常，用蟲類藥旨在取其性善走竄，可以入臟腑、經絡以搜風剔痰，即所謂“以動制動”。諸藥合用，共奏益腎填精、豁痰熄風之功，以達標本兼顧，扶正祛邪之目的。

既往實驗研究表明，熄風膠囊能下調戊四唑所致驚厥小鼠腦內c－fos的表達，減輕神經元的興奮性，并能夠通過促進小鼠腦內一氧化氮合酶的活性及表達促進一氧化氮的釋放，減輕戊四唑誘發驚厥后所出現的DNA、RNA改變，減輕癲癇后所致腦損傷，發揮神經保護作用［1］。臨床實踐已經證明熄風膠囊對小兒癲癇強直－陣攣性發作安全、有效［2］。

MFS及突觸結構損傷是顳葉癲癇形成的主要病理基礎，為癲癇長期反復發作的原因［4，5］。MFS與癲癇的SRS密切相關［6，7］。在癇性損傷后，苔蘚纖維生側支進入顆粒體層、齒狀回內分子層以及CA3區起始層，重建海馬神經網絡，形成的興奮性突觸占優勢，同時齒狀回對興奮的濾過作用降低，沖動便在再生神經回路中迅速傳播，最終導致癲癇反復發作。

本實驗中各干預組及模型組出現SE的癲癇大鼠海馬CA3始層及齒狀回分子層皆可見染色顆粒明顯增多，呈點片狀及帶狀分布。所有干預治療組海馬CA3始層及齒狀回分子層Timm染色顆粒MFS總面積低于模型組，其中在CA3區熄高組、聯髙組、聯低組與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。熄高組、聯髙組、聯低組無論是在CA3區還是在齒狀回分子層，3者作用差異無統計學意義。

本研究表明，熄風膠囊單藥及與TPM聯合用藥可以有效地減低氯化鋰－匹羅卡品癲癇大鼠的SRS，而且在聯合用藥的同時能適當減少西藥的劑量。熄風膠囊控制SRS的作用機制可能與保護神經元細胞，減輕海馬損傷，抑制MFS有關。為臨床應用中藥治療癲癇提供了理論依據。

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［2］ 馬融，李新民，魏小維，等.熄風膠囊治療小兒癲癇強直－陣攣性發作的研究［J］.天津中醫藥，2003，20（2）：87.

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The Intervention of Xifeng capsule on spontaneous recurrent seizures and hippocampalformation lesion in epileptic rats induced by Lithium－Pilocarpine

LIXin－min，QINLu－ping，LUYan－li.FirstAffiliatedHospitalofTianjinUniversityofTraditional

ChineseMedicine，Tianjin300193，China

Objective To study the intervention of Xifeng capsule single and combination effect on spontaneous recurrent seizures（SRS）and hippocampal formation lesion in epileptic rats induced by Lithium－Pilocarpine.Methods All experimental rats were randomly divided into eight groups：normal control group，model group，Xifeng high－dose group，Xifeng middle－dose group，Xifeng low－dose group，Xifeng high－dose＋ TPM group，Xifeng high－dose＋ TPM 1／2dose group，TPM group.We use lithium－pilocarpine chemical ignition method to duplicate the epileptic rat model.And with conventional histopathological method and transmission electron microscope were utilized to observe morphological changes in hippocampal formation，Timm histochemical technique was adopted to study mossy fiber sprouting.Results （1）To compare the situation from the seizures in rats，the average attack level of all rats of Intervention group lower than model group（P＜0.05），but higher than the control group（P＜0.01）.（2）All intervention group，the SRS frequencies obviously lower than model group（P＜0.05）.（3）In all intervention group，the total aera of mossy fiber sprouting（MFS）of the hippocampal CA3subfield and dentate gyrus were more than that of normal group（P＜0.05）.Both in the hippocampal CA3subfield and dentate gyrus，the total aera of mossy fiber sprouting（MFS）have significance difference between Xifeng high－dose group and Xifeng low－dose group（P＜0.05）.（4）Using conventional histopathological method and transmission electron microscope，ultrastructure of neurons in hip－pocampus was regular in normal group but damaged obviously in model group.In all therapy groups.The damage of neuron in hippocampus was ameliorated in Xifeng high－dose＋ TPM1／2dose group，in Xifeng high－dose group.The damage of neuron in hippocampus was less than in Xifeng middle－dose group and in Xifeng low－dose group.Conclusion The intervention of Xifeng capsule single and combination can effectively reduce the degree of epileptic seizures in rats，protect hippocampal neurons from being more seriously and deterred hippocampal mossy fiber sprouting（MFS）.

Epilepsy／Chinese medicine therapy； Xifeng capsule； Rat； Experiment，animal

天津市高等學?？萍及l展基金重點項目（2009ZD03）

300193天津，天津中醫藥大學第一附屬醫院兒科

李新民（1964－），男，主任醫師，博士研究生導師。研究方向：小兒腦系疾病的診斷與治療。

路巖莉，300193天津，天津中醫藥大學第一附屬醫院兒科。

10.3969／j.issn.1674－3865.2012.06.001

R－33

A

1674－3865（2012）06－0481－04

2012－09－05）

黃偉）

臨床研究