心炎寧顆粒劑對病毒性心肌炎小鼠模型心肌細胞凋亡基因Bcl－2表達的影響

孟楠， 劉芳， 王雪峰， 張秋營， 周游， 南春紅， 岳志軍

心炎寧顆粒劑對病毒性心肌炎小鼠模型心肌細胞凋亡基因Bcl－2表達的影響

孟楠， 劉芳， 王雪峰， 張秋營， 周游， 南春紅， 岳志軍

目的 觀察心炎寧顆粒劑對病毒性心肌炎小鼠心肌細胞保護作用及相關基因Bcl－2表達的影響。方法 采用腹腔注射柯薩奇B3病毒誘導BALB／c小鼠心肌炎模型，將心肌炎小鼠隨機分為模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組各25只，另設正常組小鼠25只。在病毒感染后第3、5、7、14天動態觀察不同劑量的心炎寧顆粒劑對心肌細胞保護作用和對相關調控基因Bcl－2表達的影響。結果 各劑量組較模型組心肌細胞病理損傷均減輕，其中高劑量組與模型組的病理積分差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，高、中、低劑量組的Bcl－2表達均上調，其中高劑量組上調明顯差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 心炎寧顆粒劑對感染柯薩奇病毒的小鼠心肌細胞有保護作用。

心肌炎； 心炎寧顆粒劑； 細胞凋亡； Bcl－2； RT－PCR； 動物，實驗

細胞凋亡是個體發育過程中基因調控下的細胞自殺活動，是多細胞有機體為調控機體發育、維護內環境穩定，由基因調控的細胞主動死亡過程。目前普遍認為凋亡受基因的調控，其中Bcl－2家族中的Bcl－2原癌基因被認為可以阻止細胞凋亡的發生。病毒性心肌炎時心肌細胞既有壞死，亦可發生凋亡［1］。研究發現，細胞凋亡可能是導致病毒性心肌炎引起心肌損傷并演變為心肌病的原因之一［2］。心炎寧顆粒劑為本院治療病毒性心肌炎的多年驗方，其臨床療效顯著。本實驗旨在觀察心炎寧顆粒劑對病毒性心肌炎小鼠心肌細胞的保護作用，以探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 雄性純種BALB／c小鼠125只，4～5周齡，體質量15～20g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，中國醫學科學院中國協和醫科大學實驗動物研究所，SPF級，證書號：SCXK京2009－0004。將125只BALB／c小鼠隨機分為5組，即病毒性心肌炎模型組、正常組和高、中、低劑量組各25只。柯薩奇B3病毒（CVB3m）（Nancy株）由上海中山醫院病毒性心臟病重點實驗室楊英珍教授惠贈。在Hela細胞上連傳3代，細胞病變至＋＋＋～＋＋＋＋（50%～100%細胞發生病變）后，反復凍融3次，3 000r／min離心30min，取上清液。在 HeLa細胞上滴定50%感染量（TCID50）為10－3.5，－80℃冰箱中保存留用。

1.2 儀器及試劑 一抗、二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），PBS緩沖液、蒸餾水、中性樹膠、蘇木素、枸櫞酸緩沖液等。Trizol總RNA提取試劑（invitrogen公司），DNA－marker DL2000、RT－PCR 試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）。顯微鏡（OLYMPUS BX50），切片機（德國LEICA：RM2135），計算機圖像分析儀（北京航空大學圖像中心），微波爐（蘇州三星電子有限公司，型號：7AMTA0188），電熱恒溫干燥箱（寧波機電工業研究設計院，型號：GZX－DH400－S），PCR儀（美國PE－9600），低溫高速離心機（德國Biofuge 28RS），電泳儀，凝較分析系統（上海天能EPS－300）。

1.3 實驗藥物 心炎寧顆粒劑由柴胡、黃芩、紅參、丹參等組成。由遼寧中醫藥大學附屬醫院制劑室制備（批號：遼藥制字（2003）z0026）。各劑量組的藥物濃度：高劑量組0.355g／mL，中劑量組0.177 5g／mL，低劑量組0.089g／mL。

1.4 實驗方法

1.4.1 心肌炎模型的制備 模型組和各劑量組經腹腔內接種0.2mL TCID50CVB3m的MEM Eagle液，正常對照組同法接種0.2mL不含病毒的Vero細胞培養上清液。半小時之后，觀察組按每次0.02mL／g灌胃給藥，模型組和正常對照組分別給予等量的蒸餾水灌胃，每日2次，連續14d。造模第3、5、7、14天，各組隨機取5只或剩余小鼠，麻醉處死并取其心臟。取心臟組織上1／3放入4%多聚甲醛固定液中固定，石蠟包埋，連續切片，備做病理組織學檢測。取中1／3用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續切片，做免疫組化；取下1／3置于液氮－70℃中凍存備做RT－PCR。

1.4.2 病理組織學檢查 常規HE染色，光鏡下觀察心肌病理變化，按照Rezkalla等［3］的方法計算心肌病理組織學積分。即每張切片取5個視野，計算每個視野中炎性細胞浸潤及壞死區域面積與整個視野的面積之比。無病變計0分，＜25%計1分，25%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分。

1.4.3 免疫組織化學法檢測心臟組織的Bcl－2的蛋白表達 將石蠟切片脫蠟至水，用微波輻射對抗原進行修復或暴露，滴加正常山羊血清封閉液，室溫放置20min。滴加用PBS 1∶100稀釋的一抗，37℃，2h。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG二抗，37℃，20min。滴加SABC，37℃，20min。DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封固、鏡檢。

采用計算機圖像分析系統進行分析。陽性結果判斷：以胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性表達。陽性強度判斷：每個切片隨機取5個高倍鏡視野，測定一定面積內陽性信號面積和陽性信號平均灰度值乘積，即免疫組織化學陽性信號指數＝陽性信號面積×陽性信號平均灰度／測定面積×100%。

1.4.4 RT－PCR方法檢測心肌Bcl－2基因表達 采用Trizol試劑抽取心肌組織總RNA，將獲得的總RNA按BcaBEST逆轉錄使用說明書進行合成cDNA。按RT－PCR試劑盒（寶生物工程有限公司）說明進行DNA擴增。Bcl－2和內參基因GAPHD引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，序列如下：GAPHD1上游5＇GAC ATC AAG AAG GTG GTG AAG 3＇，下游5＇TGG AAA TTG TGA GGG AGA TGC 3＇計336bp；GAPHD2上游5＇ACC ACC ATG GAG AAG GCT GG 3＇，下游5＇CTC AGT GTA GCC CAG GAT GC 3＇計528bp；Bcl－2上游5＇TAG AGG AGG TGA CCA AGA TCG 3＇，下游5＇CAC AAT AAC ATG ACG GCA ACC 3＇計352bp。按下一條件進行擴增，94℃3min預變性，94℃30s、56℃30s、72℃1min，30個循環后72℃延伸5min。RT－PCR產物經2%瓊脂糖電泳、電壓條件為1～5V／cm，溴化乙錠染色后紫外燈下觀察特異光帶。

應用天能凝膠分析系統攝像、分析電泳結果，以內參照為標準進行半定量分析。計算公式：Bcl－2相對量＝Bcl－2產物電泳條帶強度／內參電泳條帶強度×100%。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件分析，計量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠心肌組織病理改變 病毒感染后第3天，模型組與各劑量組心肌病理切片均出現數量不等的小炎癥灶與點狀壞死，各劑量組與模型組病理積分均有不同程度的升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。模型組于第5～14天有明顯的心肌細胞變性和炎性細胞浸潤，主要是淋巴細胞和單核細胞；于第7天病變達高峰，心肌有壞死，大量炎性細胞浸潤。同階段，3個劑量組病理改變仍以點狀炎癥及壞死灶為主，病變程度相對較輕，其中高劑量組與模型組的病理積分差異有統計學意義（P＜0.05）。正常組未見類似病理學改變。模型組與高、中、低劑量組小鼠感染后第3、5、7、14天心肌病變程 度比較見表1。

表1 心炎寧顆粒劑對各組不同時間病理積分的影響（±s，分）

表1 心炎寧顆粒劑對各組不同時間病理積分的影響（±s，分）

組別 n 第3天 n 第5天 n 第7天 n 第14天44高劑量組 5 1.41±0.37 5 1.30±0.24 5 1.27±0.41 8 1.22±0.59中劑量組 5 1.40±0.29 5 1.37±0.33 5 1.38±0.34 7 1.34±0.40低劑量組 5 1.59±0.22 5 1.53±0.28 5 1.51±0.25 5 1.46±0.33 F 23.291 23.566 17.591 11.791 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01模型組 5 1.40±0.32 5 1.75±0.39 5 1.87±0.47 10 1.84±0.

2.2 對心臟組織Bcl－2蛋白表達的影響 正常組小鼠心肌細胞有一定的Bcl－2表達。第3天，模型組、高、中、低劑量組的Bcl－2表達均明顯下降，與正常組比較差異有統計學意義（P＜0.05），但4組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。第5～14天，模型組Bcl－2表達仍較正常組明顯下降；3個劑量組Bcl－2表達開始增強，其中高劑量組與模型組差異有統計學意義（P＜0.05），而與正常組差異無統計學意義（P＞0.05）；中、低劑量組與其他組別相比差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 心炎寧顆粒劑對Bcl－2蛋白表達的影響

2.3 對心臟組織Bcl－2基因表達的影響 正常組可檢測到Bcl－2的mRNA表達。第3天，模型組及各劑量組的Bcl－2表達均明顯下調，且與正常組相比差異有統計學意義（P＜0.05），但4組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。第5～14天，模型組的Bcl－2表達仍較正常組明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；高劑量組Bcl－2表達增強，與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.05），而與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；中、低劑量組與其他組別相比差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 心炎寧顆粒劑對Bcl－2基因的表達

3 討論

病毒性心肌炎是指心肌細胞及其組織間隙受嗜心性病毒感染引起的局限性或彌漫性炎癥，病理上常表現為心肌細胞變性、腫脹、溶解和壞死，以及細胞組織間隙中炎性細胞的浸潤。其致病機制尚不明確，近年來認為心肌細胞的凋亡是導致病毒性心肌炎病情演變的原因之一［1］。當受病毒感染時，機體運用細胞凋亡的手段，通過犧牲個別細胞來清除外物，起到宿主的防御作用；另一方面，病毒可通過自身基因的表達，或激活宿主細胞凋亡相關基因，調控細胞凋亡，保證自身存活和繁殖，引起宿主病理改變。可見，細胞凋亡不僅是一種生理過程，也是一種病理損傷過程［4］。Bcl－2基因是一種對細胞凋亡具有明顯抑制作用的新型癌基因，主要存在于線粒體外膜、核膜和內質網膜上。它對細胞死亡的干擾有選擇性，但對細胞周期無明顯影響，是阻止細胞死亡的最后途徑。其能抑制由許多因子激發的細胞凋亡，如化療藥物、射線、某些病毒等。

本實驗通過對不同時間的各組心肌細胞病理積分的測定，來評價心炎寧顆粒劑對心肌細胞的保護作用。第3天，各劑量組與模型組間無差異，可能是由于藥物作用時間較短。第5、7、14天3個劑量組心肌組織受損程度均輕于模型組，從而推斷心炎寧顆粒劑具有保護心肌細胞的作用。同時本實驗運用免疫組織化學和RT－PCR兩種方法測定Bcl－2在各組間的表達情況，發現與模型組相比，3個劑量組Bcl－2表達均有不同程度的上調，說明心炎寧顆粒劑有增強病毒性心肌炎心肌細胞Bcl－2表達的作用。

心炎寧顆粒劑為本院的院內制劑，由《傷寒論》中的經典方小柴胡湯加減而成，具有和解少陽、疏利三焦、活血化瘀的功效。其方主要由柴胡、黃芩、黃芪、丹參等組成。研究表明，柴胡提取物可以增強Bcl－2表達，減少心肌細胞凋亡，減少心肌損傷，預防心肌纖維及擴張性心肌病的發生［5］。黃芩可以通過調節研究對象組織細胞的Bax及Bcl－2的表達，抑制組織的進一步凋亡，從而起到保護組織損傷的作用［6，7］。黃芪有增強抑凋亡基因 Bcl－2的表達，減少組織凋亡數目的作用［8，9］。丹參能顯著上調自發性高血壓大鼠心肌細胞Bcl－2基因蛋白表達，抑制心肌細胞凋亡，從而預防高血壓左室肥厚的形成［10］。本實驗表明，心炎寧顆粒劑能夠增強抑凋亡基因Bcl－2的表達，可能以此方式來降低心肌細胞凋亡的產生，減少心肌損傷，從而起到保護心肌的作用。

［1］ 胡野，凌志強，單小云.細胞凋亡的分子醫學［M］.北京：軍事醫學科學出版社，2002：3，6，283.

［2］ 彭黎明，王增禮.細胞凋亡的基礎與臨床［M］.北京：人民衛生出版社，2000：372.

［3］ Rezkalla S，Kloner RA，Khatib G，et al.Effect of metoprolol in acute coxsackievirus B3murine myocarditis［J］.J Am Coll Cardiol，1988，12（2）：412－414.

［4］ 劉旭杰，柳德學.參松養心膠囊對病毒性心肌炎小鼠模型心肌細胞凋亡及其調控基因的影響［J］.中醫研究，2010，23（9）：21－24.

［5］ 王雪峰，周麗，南春紅，等.柴胡提取物對CVB3m感染小鼠心肌細胞凋亡相關基因表達的影響［J］.中國中西醫結合雜志，2005，25（10）：925－928.

［6］ 李園園，路鋼，曾曉峰，等.黃芩苷對腦缺血－再灌注小鼠紋狀體Bax和Bcl－2蛋白表達影響［J］.昆明醫學院學報，2010，31（1）：24－27.

［7］ 孫潔，田林紅，王收寶，等.黃芩苷對糖尿病大鼠腎臟細胞凋亡及其Bcl－2和Bax表達的影響［J］.實用醫學雜志，2011，27（5）：757－760.

［8］ 趙燕玲，王宗仁.黃芪對腦缺血再灌注后神經細胞凋亡及Bcl－2蛋白表達的影響［J］.中國臨床康復，2005，9（33）：92－93.

［9］ 周健，馬立輝，孔祥玉，等.黃芪預處理對心肌細胞缺血再灌注損傷的保護作用［J］.山東醫藥，2010，50（48）：41－42.

［10］ 鄧杰，鄭智，王明明，等.丹參對自發性高血壓大鼠左室肥厚及心肌細胞凋亡的影響［J］.中醫藥學刊，2006，24（11）：2038－2040.

Effects of Xinyanning granule on the expression of apoptosis gene Bcl－2 of cardiomyocyte in mice with viral myocarditis

MENG

Nan，LIUFang，WANGXue－feng，etal.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicineGraduateSchool，Shenyang110032，China

Objective To investigate the protective effect of Xinyanning granule on myocardial cells and apoptotic regulator gene Bcl－2expression in mice with vital myocarditis.Methods The BALB／c mice inoculated with the cardiomyocytophilic strain Coxsackie virus B3m（CVB3m）by peritoneal injection were adopted as viral myocarditis model.The experimental mice were divided into the normal control group，the model group and three does groups.To observe the influence of myocardial cells and apoptotic regulator gene Bcl－2expression among at different doses groups，on the 3th，5th，7th，14th day after modeling.Results Pathology scores in three does groups were all significantly lower than that in model group，especially the high does group（P＜0.05）.The expression of Bcl－2in three does groups were all significantly higher than that in model group，especially the high does group（P＜0.05）.There is some correlation between pathology score and the expression of Bcl－2.Conclusion Xinyanning granule can protect the myocardial cells of mice with viral myocarditis.

Myocarditis； Xinyanning granule； Apoptosis； Bcl－2； RT－PCR； Experiment，animal

遼寧省重點實驗室課題（2008S152）

110032沈陽，遼寧中醫藥大學研究生院（孟楠，張秋營，周游）；遼寧中醫藥大學附屬醫院兒科（劉芳，王雪峰，南春紅，岳志軍）

孟楠（1986－），女，遼寧中醫藥大學2010級碩士研究生在讀。研究方向：小兒病毒性心肌炎的診斷與治療。

劉芳，110032沈陽，遼寧中醫藥大學附屬醫院兒科。

10.3969／j.issn.1674－3865.2012.06.007

R－33

A

1674－3865（2012）06－0496－04

2012－09－10）

黃偉）

臨床研究