響應面法優化發酵菜籽蛋白的提取工藝研究

王曉凡，熊光權，汪 蘭，王海濱

(1.武漢工業學院食品科學與工程學院，湖北武漢430023;2.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北武漢430064)

油菜在世界油料作物產量中位居前三。20世紀80年代以來，我國的油菜種植面積和產量都穩居世界第一位，菜籽中約含21%—24%的蛋白［1］。菜籽蛋白是指油菜籽榨油后從菜籽餅中提取的蛋白質，菜籽餅中蛋白質含量在30%—40%［2］，雖然本身營養價值較高，是一種潛在的優質植物蛋白資源，但由于其中還含有較多的硫甙和植酸等抗營養因子，因而大大限制了其在飼料、食品等行業的利用程度。筆者以自制的多菌種復合固態發酵脫毒后的菜籽粕為原料，初步探索發酵菜籽蛋白的優化提取工藝，對發酵菜籽蛋白資源的開發利用具有重要意義。

本文利用傳統簡便的堿提酸沉的方法提取發酵菜籽蛋白，并用響應面分析法優化各個影響因素的提取條件，主要研究了pH值、溫度、料液比3個因素對發酵菜籽蛋白提取率的影響，以期為發酵菜籽蛋白的進一步開發利用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

菜籽粕由中國農業科學院油料作物研究所提供，經多菌種復合固態發酵后得到本試驗的原料即發酵菜籽粕。發酵菜籽粕的主要成分見表1。

表1 發酵菜籽粕的主要成分 /%

1.2 儀器設備

數顯鼓風干燥箱：GZX-9070ME，上海博迅實業有限公司醫療設備廠;分析天平：AL204，METTLER TOLEDO;馬弗爐：DRZ-4型，上海實驗電爐廠;分光光度計：715型，上海分析儀器廠。

1.3 發酵菜籽蛋白提取工藝研究

1.3.1 堿提酸沉工藝［3］

稱取一定量的發酵菜籽粕，調節反應溫度、料液比、pH值三個參數，攪拌20 min浸提3次后靜置，將料液進行3500 r/min離心20 min后取上清液。上清液用0.5 mol/L HCl分別調節pH值到3.8和5.8，再分別離心20 min，將沉淀調至中性后冷凍干燥，即得發酵菜籽蛋白。

式中，W0為上清液中發酵菜籽蛋白質質量，W1為發酵菜籽粕中總蛋白質量。

1.3.2 響應面法對堿提發酵菜籽蛋白條件的優化［4-6］

結合各個影響因子的單因素試驗結果，對pH值、溫度、料液比3個因素進行因素水平試驗的優化設計，利用專業軟件Designer—Expert 7.0進行數據擬合處理，試驗因素水平見表2。

表2 發酵菜籽蛋白提取工藝試驗因素水平

1.3.3 酸沉發酵菜籽蛋白的優化

選取調節pH2.8—7.8，對提取出的發酵菜籽蛋白溶液進行沉淀，以發酵菜籽蛋白的沉淀率為指標進行參數優化。

式中，W0為上清液中發酵菜籽蛋白質質量［7］，W2為發酵菜籽蛋白制品的質量。

1.4 測定方法

蛋白含量的測定：采用凱氏定氮法，參照GB/T 9823-2008。

水分含量的測定：采用常壓干燥法，參照GB/T 5009.3-2003。

脂肪含量的測定：采用索氏提取法，參照GB/T 5009.6-2003。

灰分的測定：采用碳化灼燒法，參照 GB/T 5009.4-2003。

硫甙含量的測定：氯化鈀分光光度計法［8］。

植酸含量的測定：三氯化鐵比色法［9］。

2 結果與分析

2.1 不同提取條件對發酵菜籽蛋白提取率的影響

2.1.1 不同提取pH值對發酵菜籽蛋白提取率的影響

由圖1可知，發酵菜籽蛋白的提取率隨pH值的升高而升高。pH值為13時發酵菜籽蛋白提取率可達到53.15%，這是因為在堿性環境中發酵菜籽蛋白與水的親合力較強。pH值大于13時，提取液逐漸變暗出現黑色，是發酵菜籽蛋白在強堿溶液中變性［5］。在所選pH值范圍內，pH值為13時發酵菜籽蛋白的提取效果較理想。

圖1 pH值對發酵菜籽蛋白提取率的影響

2.1.2 不同提取溫度對發酵菜籽蛋白提取率的影響

圖2 溫度對發酵菜籽蛋白提取率的影響

由圖2可知，發酵菜籽蛋白的提取率剛開始是隨溫度上升而增加，在55℃時發酵菜籽蛋白的提取率達到最大值，由于溫度升高，發酵菜籽蛋白的分子運動加劇而使蛋白提取率明顯增大。55℃之后發酵菜籽蛋白的提取率下降可能因為溫度過高，發酵菜籽蛋白發生變性［5］。所以在所選溫度范圍內，在55℃時提取發酵菜籽蛋白的效果最好。

2.1.3 不同料液比對發酵菜籽蛋白提取率的影響

由圖3可知，發酵菜籽蛋白的提取率隨著料液比的增大而增加，在料液比l∶15時提取率達到最大值。在l∶15以后，發酵菜籽蛋白的提取率會逐漸下降，這是因為料液比過大會將一些堿溶性非蛋白和水溶性蛋白物質溶解出來［5］。所以在所選料液比范圍內，料液比為l∶15時發酵菜籽蛋白的提取效果最為理想。

圖3 料液比對發酵菜籽蛋白提取率的影響

2.2 響應面法對堿提發酵菜籽蛋白的條件優化

綜合考慮發酵菜籽蛋白提取率與經濟效益之間的關系，響應面法優化試驗只考察pH值、溫度和料液比3個因素對發酵菜籽蛋白提取率的影響。以pH值(Z1)、溫度(Z2)、料液比(Z3)為自變量，以發酵菜籽蛋白的提取率為響應值進行響應面優化分析，試驗結果見表3。方差分析表明R2=0.9947，此時回歸方程達到極顯著水平(P＜0.001)。將所得試驗數據做數學模型擬合，獲得發酵菜籽蛋白提取率與溫度(B)、pH(A)值和料液比(C)的回歸方程如下：

表3 發酵菜籽蛋白提取工藝的響應面設計和結果

分別取pH值、溫度和料液比為零水平，考察其余2個因素的交互作用對發酵菜籽蛋白的提取率的影響，各個因素交互作用的響應面見圖4—圖6。由各圖的曲面變化率可以清晰地看出，pH值對發酵菜籽蛋白提取率的影響最為顯著，料液比和溫度次之。經過專業軟件分析回歸方程得到：在pH值12.4，溫度55.7℃，料液比為1∶16.2時，發酵菜籽蛋白的提取率達到最大，為64.79%。此試驗設計的中心值與優化所得的反應條件比較相近。并且此時兩者發酵菜籽蛋白的提取率也比較接近，這表明此回歸方程能夠較好地反映出pH值、溫度和料液比與發酵菜籽蛋白提取率的變化關系。

圖4 pH值和溫度對發酵菜籽蛋白提取率的交互影響

圖5 pH值和料液比對發酵菜籽蛋白提取率的交互影響

圖6 溫度和料液比對發酵菜籽蛋白提取率的交互影響

2.3 酸沉發酵菜籽蛋白的優化

選用pH2.8—7.8對提取出的發酵菜籽蛋白溶液進行沉淀，其沉淀率的變化如圖7所示。由圖7可知，在pH3.8和pH5.8時發酵菜籽蛋白的沉淀率最高，都超過69%，因此我們采用pH3.8和pH值5.8的兩步沉淀法來制備發酵菜籽蛋白，分別沉淀不同等電點的發酵菜籽蛋白，從而達到分離純化的目的。

圖7 不同pH值下的發酵菜籽蛋白沉淀率

3 結論

(1)本試驗利用堿提酸沉的方法初步探索了發酵菜籽蛋白的提取工藝。分別從pH值、溫度和料液比3個因素進行了單因素分析，得出了發酵菜籽蛋白提取的最佳工藝條件，即：pH值12，溫度55℃，料液比1∶15，提取時間為20 min，提取次數為3次。

(2)在各個單因素試驗的基礎上，筆者又對pH值、溫度和料液比3個因素進行響應面優化分析，確定了提取發酵菜籽蛋白的最佳條件，即在pH值12.4，溫度55.7℃，料液比為1∶16.2時，發酵菜籽蛋白的提取率達到最大值。

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