體外誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞成血管平滑肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

許志成 李宏 張群

體外誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞成血管平滑肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

許志成 李宏 張群

目的 探討體外誘導(dǎo)人毛囊干細(xì)胞成血管平滑肌細(xì)胞的可行性。方法 采用中性蛋白酶（Dispase）分離人毛囊干細(xì)胞，用含10 ng/mL PDGF-BB、10%血清的低糖DMEM誘導(dǎo)液對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，無PDGF-BB的培養(yǎng)液為對(duì)照組，觀察每代細(xì)胞形態(tài)，誘導(dǎo)4代后檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SM actin）與肌鈣結(jié)合蛋白（Calponin）的表達(dá)。結(jié)果 在誘導(dǎo)液的作用下，細(xì)胞形態(tài)逐步向平滑肌樣轉(zhuǎn)變，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)改變不顯著。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)顯示，至第4代，實(shí)驗(yàn)組已明顯表達(dá)α-SM actin與Calponin，對(duì)照組表達(dá)不明顯；流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組α-SM actin與Calponin陽性表達(dá)率近50%，對(duì)照組則低于8%；RT-PCR顯示，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)Calponin，而對(duì)照組未見明顯表達(dá)。結(jié)論 使用含10 ng/mL PDGF-BB的低糖DMEM培養(yǎng)液可體外誘導(dǎo)人毛囊干細(xì)胞成血管平滑肌細(xì)胞。

毛囊干細(xì)胞 血管平滑肌細(xì)胞 組織工程

血管平滑肌細(xì)胞是構(gòu)建組織工程血管主要的種子細(xì)胞，“保證細(xì)胞數(shù)量”和“維持細(xì)胞活性”是細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中不易調(diào)和的矛盾，成為制約血管組織工程研究的主要瓶頸[1]。近年來的研究表明，存在于毛囊外根鞘的毛囊干細(xì)胞體外分離純化后，經(jīng)誘導(dǎo)可向多種組織轉(zhuǎn)化，有利于組織再生[2-4]。Amoh等[5]研究發(fā)現(xiàn)，鼠皮膚新生毛細(xì)血管可源自毛囊干細(xì)胞，Liu等[6]證實(shí)綿羊毛囊干細(xì)胞中含有平滑肌前體細(xì)胞，純化培養(yǎng)后可形成有收縮功能的平滑肌細(xì)胞，這說明頭發(fā)毛囊中的干細(xì)胞具有形成血管壁細(xì)胞的潛力。毛囊組織來源豐富，毛囊干細(xì)胞可在體外大量培養(yǎng)擴(kuò)增，若能分化為血管壁細(xì)胞，則能提供充足的細(xì)胞量，從而解決心血管組織再生工程中細(xì)胞來源的重要問題。本實(shí)驗(yàn)分離人毛囊干細(xì)胞，采用PDGF-BB對(duì)其進(jìn)行體外誘導(dǎo)，觀察細(xì)胞在誘導(dǎo)擴(kuò)增后，表達(dá)平滑肌細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的情況，為進(jìn)一步體外血管構(gòu)建提供種子細(xì)胞。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)液、中性蛋白酶、胰蛋白酶、K-SFM（Define Keratinocyte Serum Free Medium）培養(yǎng)液、添加EGF和牛垂體提取物（Gibco公司，美國）；胎牛血清（Hyclone 公司，美國）；維生素 50 mg/L、L-谷氨酰胺 300 mg/L、青霉素、鏈霉素（Sigma 公司，美國）；鼠抗人 α-SM actin、鼠抗人 calponin（DAKO 公司，美國）；羊抗鼠 lgG-FITC（Santa Cruz公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 毛囊干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

選取整形外科手術(shù)中切除的健康成人頭皮5例（獲患者知情同意），毛囊外根鞘的富集方法、毛囊干細(xì)胞的富集方法參照文獻(xiàn)[7－8]。

1.2.2 毛囊干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

將PDGF-BB用稀釋液（DMEM培養(yǎng)液）稀釋成濃度 1 μg/mL，分裝至 Eppendorf管中，于-20 ℃冷凍保存，使用前即時(shí)加入，其培養(yǎng)液中的終濃度為10 ng/mL。取第1代毛囊干細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，在細(xì)胞全部貼壁后，加入含10 ng/mL PDGF-BB、10%血清的DMEM誘導(dǎo)液，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的條件下培養(yǎng)，隔日更換2/3量的培養(yǎng)液，注意觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，一般4～5 d后達(dá)到融合狀態(tài)，可繼續(xù)用誘導(dǎo)液傳代培養(yǎng)。待鏡下觀察出現(xiàn)類似血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)改變時(shí)，可進(jìn)行平滑肌細(xì)胞特異性表型的鑒定。對(duì)照組使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，與實(shí)驗(yàn)組同期傳代，同期觀察。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡觀察各代毛囊干細(xì)胞形態(tài)變化，觀察在誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的培養(yǎng)情況下，兩組細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)是否向血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)變。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)α-SM actin和Calponin表達(dá)

分別收集實(shí)驗(yàn)組第4代細(xì)胞與對(duì)照組第4代細(xì)胞，用丙酮固定15 min，PBS漂洗，10%羊血清封閉30 min，加入0.1%BSA稀釋的抗體：α-SMA和Calponin（1∶100），37 ℃孵育 45 min；PBS 漂洗，滴加FITC標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗。碘化丙啶襯核后，熒光顯微鏡下觀察。以臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞作為陽性對(duì)照，人耳廓軟骨細(xì)胞為陰性對(duì)照。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)α-SMA和Calponin陽性細(xì)胞表達(dá)率

采用胰酶消化法收集實(shí)驗(yàn)組第4代細(xì)胞與對(duì)照組第4代細(xì)胞，消化得細(xì)胞懸液，離心5 min制備單細(xì)胞懸液，滴加0.25%TritonX-100作用5 min，PBS漂洗，離心5 min；分裝入4個(gè)1.5 mL Eppendorf管，保證每管不少于1×106個(gè)細(xì)胞，其中3管內(nèi)分別加入抗α-SMA抗體和抗Calponin抗體各10 μL，4℃孵育40 min；PBS漂洗，離心5 min，洗掉未結(jié)合抗體；各管同時(shí)加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗4 μL，4℃孵育30 min，離心5 min，洗掉未結(jié)合抗體。以只加FITC標(biāo)記二抗，而未加一抗的細(xì)胞為同型對(duì)照，1%多聚甲醛固定后送檢。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)Calponin表達(dá)

實(shí)驗(yàn)分4組：實(shí)驗(yàn)組第4代細(xì)胞、對(duì)照組第4代細(xì)胞、正常平滑肌細(xì)胞（陽性對(duì)照）、軟骨細(xì)胞（陰性對(duì)照）。以β-actin作為cDNA定量的內(nèi)參照。根據(jù)GenBank報(bào)告的序列設(shè)計(jì)引物，β-actin上游引物為：5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAA-3’；下游引物為 ：5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’。 Calponin上游引物為：5’-GGCGAAGACGAAAGGAAA-3’；下游引物為：5’-GGTACTCGGGAGTCAGACA-3’。 抽提各組細(xì)胞mRNA后，按試劑盒中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與聚合酶鏈反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠、80 V電壓下電泳45 min。應(yīng)用天能電泳圖像分析系統(tǒng)在紫外光下觀察各基因表達(dá)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

原代毛囊干細(xì)胞剛貼壁時(shí)仍保持其原有的形態(tài)特征。3～5 d后，細(xì)胞逐漸伸展，在誘導(dǎo)液的作用下，細(xì)胞形態(tài)逐步由小圓形開始向長(zhǎng)梭形平滑肌樣轉(zhuǎn)變，至第4代，平滑肌樣形態(tài)更加明顯，融合后形成峰谷排列，呈良好的分化狀態(tài)；未誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)改變不顯著，平滑肌樣形態(tài)轉(zhuǎn)變不明顯（圖1、2）。

2.2 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)

對(duì)體外誘導(dǎo)至第4代的毛囊干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)平滑肌細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白與肌鈣結(jié)合蛋白的表達(dá)，可見其胞漿有絲狀熒光束呈現(xiàn)，即毛囊干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后已產(chǎn)生平滑肌細(xì)胞骨架蛋白相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，而對(duì)照組胞漿熒光表達(dá)不顯著（圖3、4）。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

α-SM actin與Calponin在原代接種時(shí)的表達(dá)陽性率分別為（4.15±0.35）%和（3.61±0.28）%。 誘導(dǎo)至第4代，實(shí)驗(yàn)組陽性率分別為（56.16±0.77）%和（49.45±0.65）%，明顯高于誘導(dǎo)培養(yǎng)之前（P<0.05）；對(duì)照組陽性率分別為（6.87±0.94）%和（7.64±0.86）%，明顯低于實(shí)驗(yàn)組（P<0.05）（表1）。

2.4 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組和陽性對(duì)照組（正常血管平滑肌細(xì)胞）在447 bp處出現(xiàn)明顯條帶，說明兩組均表達(dá)Calponin，而對(duì)照組和陰性對(duì)照組（軟骨細(xì)胞）則不表達(dá)Calponin。

圖1 原代毛囊干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（倒置相差顯微鏡，100×）Fig.1 Morphological observation of FSCs of P0(IPCM,100×)

圖2 誘導(dǎo)后第4代毛囊干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（倒置相差顯微鏡，100×）Fig.2 Morphological observation of induced FSCs of P4(IPCM,100×)

圖3 誘導(dǎo)后毛囊干細(xì)胞α-SM actin的表達(dá)（倒置相差顯微鏡，200×）Fig.3 The expression of α-SM actin in induced FSCs(IPCM,200×)

圖4 誘導(dǎo)后毛囊干細(xì)胞Calponin的表達(dá)（倒置相差顯微鏡，200×）Fig.4 The expression of Calponin in induced FSCs(IPCM,200×)

圖5 RT-PCR檢測(cè)Calponin的表達(dá)Fig.5 The expression of Calponin by RT-PCR

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組α-SM actin與Calponin陽性細(xì)胞表達(dá)率Table 1 Expression rate of α-SM actin and Calponin in each group by FACS

3 討論

我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中，以畢格犬的血管平滑肌細(xì)胞為種子細(xì)胞,采用仿生性生物反應(yīng)器輔助，成功構(gòu)建了具有一定生物力學(xué)性能和組織學(xué)結(jié)構(gòu)的組織工程血管[9]，說明反應(yīng)器有利于提高構(gòu)建血管的力學(xué)性能和組織結(jié)構(gòu)。但我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用終末成熟分化的血管平滑肌細(xì)胞作為種子細(xì)胞體外培養(yǎng)易老化，擴(kuò)增效率降低，直接影響到構(gòu)建血管的力學(xué)性能和組織結(jié)構(gòu)。自體毛囊干細(xì)胞來源廣泛、取材時(shí)生理干擾小，有很強(qiáng)增殖能力、不易老化，體外誘導(dǎo)可多向分化，無免疫排斥反應(yīng)，使得體外誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞成血管平滑肌細(xì)胞有望成為解決該問題的最佳選擇。

由于血管發(fā)育是先由內(nèi)皮細(xì)胞形成單層細(xì)胞層，而后未分化的間充質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞等因子介導(dǎo)下，包繞其形成原始血管，經(jīng)過不斷重建形成成熟血管。內(nèi)皮細(xì)胞分泌PDGF-BB的培養(yǎng)環(huán)境對(duì)于未分化的間充質(zhì)細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞是至關(guān)重要的，因而本實(shí)驗(yàn)采用單一誘導(dǎo)因子PDGF-BB，主要作用是促進(jìn)細(xì)胞增殖與未分化的干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞的分化增殖，實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)潔，免去轉(zhuǎn)基因操作等繁瑣步驟，同時(shí)也便于觀察分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

在鑒定毛囊干細(xì)胞是否誘導(dǎo)為血管平滑肌細(xì)胞時(shí)，本實(shí)驗(yàn)選擇了α-SM actin與Calponin兩個(gè)指標(biāo)。前者是平滑肌細(xì)胞細(xì)肌絲的主要成分，存在于分化或未分化的細(xì)胞，而后者不僅在調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮上起重要作用，而且是細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志之一，僅存在于分化成熟的細(xì)胞，是判別干細(xì)胞是否誘導(dǎo)分化為成熟平滑肌細(xì)胞的重要指標(biāo)，也是對(duì)α-SM actin檢測(cè)的補(bǔ)充。檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)誘導(dǎo)的毛囊干細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為平滑肌樣呈長(zhǎng)梭形生長(zhǎng)，對(duì)照組則形態(tài)改變不明顯。熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞漿呈現(xiàn)綠色肌絲樣熒光條帶，可見干細(xì)胞骨架已表現(xiàn)為平滑肌細(xì)胞的類似結(jié)構(gòu)，而對(duì)照組細(xì)胞漿的熒光較弱。RTPCR從基因水平進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞有明顯的平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)，誘導(dǎo)率為50%～60%，明顯高于對(duì)照組的6%～8%，證明本實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)體系具有較高的誘導(dǎo)效率。

本實(shí)驗(yàn)建立了較為有效的誘導(dǎo)體系，同時(shí)建立了較為完整的毛囊干細(xì)胞分離純化培養(yǎng)和表型檢測(cè)的方法，為進(jìn)一步研究血管構(gòu)建與血管缺損的修復(fù)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為血管疾病的治療提供了新的思路與選擇。

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Preliminary Study on Inducing Hair Follicle Stem Cells into Vascular Smooth Muscle Cells in Vitro

XU Zhicheng1,LI Hong2,ZHANG Qun1.1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth people's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 Hangzhou Electronic Science and Technology University,Zhejiang 310018,China.

XU Zhicheng(E-mail:xuzhichengmd@163.com).

ObjectiveTo investigate the feasibility of inducing human hair FSCs (follicle stem cells)into VSMCs(vascular smooth muscle cells)in vitro.MethodsThe human hair FSCs were isolated by dispase and cultured in DMEM containing 10 ng/mL PDGF-BB as experimental group，and the human hair FSCs cultured in DMEM without PDGF-BB were set up as control group.The morphological change of each passage was observed,the expression of α-Smooth Muscle actin(α-SM actin)and calponin in each group were tested after inducing FSCs at passage 4.ResultsThe VSMC-like change was obviously observed in the induced FSCs,while the same phenomenon was not found in control group.α-SM actin and calponin were expressed by immunocytochemical staining in the induced FSCs of fourth passage,while little expression was observed in the control group.FCM showed nearly 50%of expression rate of α-SM actin and calponin in the experimental group,much higher than 8%in control group.RT-PCR further confirmed the expression of calponin in experimental group,and no obvious expression of calponin was tested in control group.ConclusionFSCs can be induced into VSMCs in vitro by DMEM containing 10 ng/mL PDGF-BB.

Follicle stem cells;Vascular smooth muscle cells;Tissue engineering

Q813.1+1

A

1673－0364（2012）04－0181－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.04.001

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目 (81000842)。

200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科（許志成，張群）；310018 浙江省杭州市 杭州電子科技大學(xué)（李宏）。

許志成（E-mail:xuzhichengmd@163.com）。

2012年6月7日；

2012年7月19日）