PRP促進(jìn)光老化人皮膚成纖維細(xì)胞膠原與透明質(zhì)酸合成的研究

鄧辰亮 常毅 萬(wàn)偉東 鄭江紅 屈悅 茅廣宇 丁志 楊松林

PRP促進(jìn)光老化人皮膚成纖維細(xì)胞膠原與透明質(zhì)酸合成的研究

鄧辰亮 常毅 萬(wàn)偉東 鄭江紅 屈悅 茅廣宇 丁志 楊松林

目的 體外研究人皮膚成纖維細(xì)胞（HSFs）發(fā)生光老化時(shí)，富血小板血漿（PRP）對(duì)其合成膠原與透明質(zhì)酸的影響。方法 使用紫外線（UVA）照射體外培養(yǎng)的原代人皮膚成纖維細(xì)胞，并檢測(cè)光老化細(xì)胞的細(xì)胞增殖情況及細(xì)胞倍增時(shí)間。用含不同濃度PRP（10%、30%、50%）的培養(yǎng)液培養(yǎng)光老化細(xì)胞，正常培養(yǎng)的光老化細(xì)胞為陰性對(duì)照，原代人皮膚成纖維細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照。ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞外液中膠原蛋白與透明質(zhì)酸含量。結(jié)果 經(jīng)紫外線照射后，細(xì)胞增殖減弱，加入PRP后，伴隨PRP濃度的增加，細(xì)胞倍增時(shí)間縮短；ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)UVA照射的成纖維細(xì)胞COL1、COL3及透明質(zhì)酸合成量，顯著低于正常培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞（P<0.01）。在PRP作用后，成纖維細(xì)胞的COL1、COL3及透明質(zhì)酸合成量均明顯增加（P＜0.01）。結(jié)論 PRP能顯著促進(jìn)光老化人皮膚成纖維細(xì)胞膠原與透明質(zhì)酸合成，可應(yīng)用于皮膚抗衰老的研究。

富血小板血漿 光老化 皮膚成纖維細(xì)胞 膠原蛋白 透明質(zhì)酸

紫外線（UV）照射導(dǎo)致皮膚發(fā)生光老化，臨床表現(xiàn)為皮膚失水、松弛、皺紋增加以及彈性下降；組織學(xué)上則表現(xiàn)為皮膚膠原纖維、彈性纖維斷裂，透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）含量減少。皮膚膠原蛋白及透明質(zhì)酸由真皮層內(nèi)的成纖維細(xì)胞合成[1]，探索促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白及透明質(zhì)酸的方法，有望成為對(duì)抗皮膚光老化的又一途徑。

富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）是全血經(jīng)分離后得到的血小板濃縮物，含有大量的生長(zhǎng)因子，如血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子－β（TGF-β）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）等[2-3]。這些生長(zhǎng)因子都能促進(jìn)正常的成纖維細(xì)胞合成膠原與透明質(zhì)酸。然而，PRP對(duì)于光老化的人皮膚成纖維細(xì)胞合成膠原與透明質(zhì)酸的促進(jìn)作用，目前仍缺乏相關(guān)研究報(bào)道。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

胎牛血清 （上海洛神生物科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（Gibico公司）；6孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板、T75 細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning 公司）；0.22 μm 一次性濾器（Millipore 公司）；ELISA 試劑盒（R&D systems公司）。

CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；恒溫水浴箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器廠）；離心機(jī)（上海安亭實(shí)驗(yàn)儀器廠）；高速低溫離心機(jī)（Eppendorf公司）；UVA紫外燈（廣東雪萊特光電科技股份有限公司）；紫外輻照計(jì)UV-A型（北京師范大學(xué)光電儀器廠）。

1.2 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

取整形外科上瞼或下瞼手術(shù)時(shí)切除的健康皮膚，供者年齡30～46歲（獲知情同意）。皮膚標(biāo)本采集后除去皮下脂肪并剪成3 mm寬的條形，以0.25%DispaseⅡ 4℃消化8～11 h，用眼科鑷掀去表皮，保留真皮組織，PBS清洗真皮組織3次后剪碎，加入0.1%復(fù)合膠原酶，37℃消化4 h，通過(guò)100目無(wú)菌不銹鋼紗網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，1 000 r/min離心10 min，去上清，用含10%胎牛血清的DMEM重懸，備用。

1.3 PRP的制備及稀釋

用預(yù)先裝有3.0 mL肝素鈉的50 mL針筒，以18 G針頭取供者全血（獲知情同意）30 mL，注入6支塑料離心管，每管5 mL，以Aghallo法進(jìn)行離心。分2次離心，第一次215 g離心10 min，吸取全部上清液至交界面下約3 mm，移至另一離心管，平衡后再次離心，第二次863 g離心10 min，離心管中液體分為兩層，上層上清液為貧血小板血漿（Plateletpoor plasma），下層為血小板濃縮物（Platelet concentrate，PC）。吸取約3/4上清液棄掉，剩余約0.7 mL搖勻，即PRP。

1.4 成纖維細(xì)胞光老化實(shí)驗(yàn)

按每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度，接種于6孔板上。使用15 J/cm2的360 nm的UVA照射成纖維細(xì)胞，使細(xì)胞發(fā)生光老化。細(xì)胞被分為5組，即陽(yáng)性對(duì)照組（正常培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞+PBS）、陰性對(duì)照組（UVA+PBS）、小劑量組（UVA+10%PRP）、中劑量組（UVA+30%PRP）、大劑量組（UVA+50%PRP）。 測(cè)量燈管與6孔板照射平面之間距離為15 cm，用紫外輻照計(jì)測(cè)量此平面UVA照射功率，測(cè)量前長(zhǎng)波紫外燈預(yù)熱30 min，待照射功率穩(wěn)定后測(cè)得功率為19.7 mJ/s，照射時(shí)以PBS置換培養(yǎng)基，掀開(kāi)蓋子，在恒溫水浴箱中將細(xì)胞暴露于UVA輻照裝置下，照射距離為15 cm。照射前2 h加入PBS和不同濃度PRP各5 mL，培養(yǎng)板置入37℃恒溫水浴箱中，照射后含10%小牛血清的DMEM換液，置入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收樣。分別于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)后及照射后 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h、120 h進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5 細(xì)胞倍增時(shí)間測(cè)定

受以上劑量照射后的成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后終止培養(yǎng)，計(jì)數(shù)每瓶中的細(xì)胞數(shù)，并按下式計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間（TD）：TD=0.693(T2-T1)/ln(N2/N1)，TD是T1至T2時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的倍增時(shí)間，N2是在T2時(shí)間的細(xì)胞數(shù)，N1是在T1時(shí)間的細(xì)胞數(shù)。

1.6 ELISA分析測(cè)量透明質(zhì)酸

收集各組分第7天的培養(yǎng)液進(jìn)行COL1、COL3、HA的ELISA檢測(cè)。按說(shuō)明書(shū)加標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將陰性、陽(yáng)性對(duì)照組以及待檢測(cè)樣品按設(shè)計(jì)孔位加入96孔板，每孔100 μL。按說(shuō)明書(shū)操作，除空白組外均加入50 μL的檢測(cè)緩沖液。混勻，37℃恒溫孵育30 min。孵育之后棄液，用緩沖液沖洗4次，每孔加入100 μL的有效酶。混勻后，加蓋37℃孵育30 min。沖洗緩沖液將檢測(cè)板清洗4次，每孔加入100 μL酶作用物。避光室溫孵育5 min，加入50 μL的反應(yīng)終止溶液終止反應(yīng)。15 min內(nèi)，在405 nm波長(zhǎng)下觀察吸光率。測(cè)出HA的濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)觀察

原代成纖維細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖數(shù)增加。紫外線照射后，細(xì)胞增殖速度和最大增殖數(shù)均較未被照射的細(xì)胞顯著降低（P<0.05）（圖1）。

伴隨PRP濃度的增加，細(xì)胞倍增時(shí)間有縮短的趨勢(shì)。PRP濃度在30%和50%時(shí)，細(xì)胞倍增時(shí)間的縮短明顯小于未添加PRP組（P<0.05）（圖2）。

2.2 ELISA檢測(cè)膠原蛋白及透明質(zhì)酸含量

培養(yǎng)至第7天的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液ELISA分析發(fā)現(xiàn)，伴隨PRP濃度增加，細(xì)胞合成的COL1、COL3與HA量有增加的趨勢(shì)，當(dāng)PRP使用濃度達(dá)到30%～50%時(shí)，COL1、COL3與HA的增加較PRP濃度為 10%～30%時(shí)更為明顯（P<0.05）（圖3）。

圖1 紫外線照射前后成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of fibroblasts before and after ultraviolet irradiation

圖2 不同濃度PRP培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞倍增時(shí)間比較Fig.2 Comparison of cell doubling time in each group

圖3 不同濃度PRP培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞膠原蛋白與透明質(zhì)酸合成比較Fig.3 Comparison of collagen and hyaluronic acid production of UV-A irradiated fibroblasts treated by different concentration of PRP

3 討論

紫外線（UV）包括UVA與UVB，是導(dǎo)致皮膚發(fā)生老化的重要原因[1]。UVA是生活紫外線，可穿透玻璃和云層射入皮膚；UVB是戶外紫外線，暴露在室外時(shí)直接接觸UVB，但UVB易被云層阻隔[4]。日常生活中，人們主要接觸UVA。因此，我們采用UVA照射皮膚成纖維細(xì)胞，以模擬日常的皮膚光老化。

皮膚光老化的研究中，皮膚成纖維細(xì)胞已成為研究重點(diǎn)[5-6]，包括光老化時(shí)細(xì)胞的基因[7]和受體的改變[8]，以及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路的變化等[9]。

目前的研究包括激光治療[10]、細(xì)胞治療[11-12]以及中藥治療等各種新方法[13-14]。本研究將富血小板血漿（PRP）作為研究對(duì)象，因?yàn)镻RP有自源性且富含多種高濃度生長(zhǎng)因子。因此，PRP不會(huì)出現(xiàn)異體的免疫排斥；同時(shí)PRP中各生長(zhǎng)因子的比例與體內(nèi)正常比例相符，使生長(zhǎng)因子之間產(chǎn)生最佳的協(xié)同作用[15]。

透明質(zhì)酸與膠原蛋白是人體真皮組織中的重要組成部分，隨著紫外線的不斷照射以及年齡的增加，皮膚內(nèi)透明質(zhì)酸與膠原蛋白的含量逐漸減低，真皮組織被氧化，皮膚塌陷、萎縮。皮膚在外觀上表現(xiàn)為粗糙、干燥、皺紋增大、松弛等一系列衰老征象。

通過(guò)應(yīng)用ELISA測(cè)定膠原蛋白、透明質(zhì)酸功能變化，在體外實(shí)驗(yàn)中探索PRP是否有直接改善皮膚光老化可能。ELISA測(cè)定透明質(zhì)酸功能變化結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞接受紫外線照射后，其合成的膠原和透明質(zhì)酸量較未被照射的成纖維細(xì)胞顯著降低，伴隨PRP使用濃度的增加，細(xì)胞合成的膠原與透明質(zhì)酸量有增加的趨勢(shì)，在PRP濃度為10%～30%時(shí)，其膠原與透明質(zhì)酸量略有升高，當(dāng)PRP使用濃度達(dá)到30%～50%時(shí)，其膠原與透明質(zhì)酸量增加幅度明顯。由于缺少定量分析，PRP是通過(guò)使單個(gè)細(xì)胞合成量增加，還是使細(xì)胞數(shù)量增加進(jìn)而使膠原與透明質(zhì)酸量升高，或是二者兼而有之，目前尚無(wú)法判斷。

上述結(jié)果提示，使用PRP能改善皮膚光老化細(xì)胞的膠原以及HA的分泌功能。但PRP是否可以作為一種填充劑，被用于皮下注射，以實(shí)現(xiàn)減少皺紋、抗衰老的效果，還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

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The Effect of PRP Promoting the Expression of Collagen and Hyaluronic Acid of Light Aging Human Skin Fibroblasts in Vitro

DENG Chenliang,CHANG Yi,WAN Weidong,ZHENG Jianghong,QU Yue,MAO Guangyu,DING Zhi,YANG Songlin.Department of Plastic Surgery,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200233,China.

YANG Songlin(E-mail：alcee@126.com).

ObjectiveTo explore the effects of platelet-rich plasma (PRP)on collagen and hyaluronic acid(HA)expression of light aging human skin fibroblasts (HSFs)in vitro.MethodsCultured human skin fibroblasts were radiated with ultraviolet ray and the proliferation and doubling time of cell were estimated.Different concentrations(10%,30%and 50%)of PRP were added into cultured light aging human skin fibroblasts,and HSFs radiated with ultraviolet ray were taken as negative control and HSFs were taken as positive control.ELISA was used to measure collagen expression and hyaluronic acid expression.ResultsThe cell proliferation was prohibited after ultraviolet irradiation and cell doubling time was shortened with the increasing of PRP concentration after PRP added.ELISA assay showed that the collagen type 1(COL1),type 3 (COL3)and HA expression were decreased after ultraviolet irradiation and promoted after PRP added,significant difference was shown between expermental groups and negative control group (P<0.01).ConclusionPRP can promote the synthesis of collagen type 1(COL1),type 3(COL3)and HA,and may be used as an effective factor against skin photoaging.

Platelet-rich plasma;Light aging;Skin fibroblasts;Collagen;Hyaluronic acid

R594.1+1

A

1673－0364（2012）04－0201－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.04.005

國(guó)家自然科學(xué)基金（81000837）。

200233 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院整形外科。

楊松林（E-mail：alcee@126.com）。

2012年6月7日；

2012年6月22日）