應用攪拌棒吸附-熱脫附-氣相色譜/質譜法分析煙草中揮發性與半揮發性物質

李 理，楊新周，劉汗青,*

（1.昆明冶金高等專科學校環境工程學院，昆明 650033；2.云南煙草科學研究院，昆明 650106）

煙草中含有豐富的揮發性、半揮發性成分，這些物質與煙草質量密切相關，對煙氣的感官性質有重要影響，因此被列為評價煙草質量的重要參數[1]。以往的分析方法中，無論是水蒸氣蒸餾，還是同時蒸餾萃取都需要大量有機溶劑進行前處理[2]，且操作時間較長、繁瑣，不能滿足快速準確分析的要求。

固態萃取攪拌棒（SBSE）是近幾年新發展起來的技術之一。1999年加拿大學者 Arthur和Janusz Pawliszyn等學者在研究固相微萃取（SPME）技術時發現，雖然樣品中被測定物質的濃度很高，但是SPME測定的回收率仍然很低，測定的靈敏度仍然不夠高[3]。他們通過研究發現：將聚二甲基硅氧烷（PDMS）涂敷在萃取棒上（膜厚0.5-1.0mm），萃取棒固相萃取體積是SPME的50倍以上[4]，具有比SPME更小的相比（水相體積/PDMS相體積），獲得了很高的測定靈敏度和回收率。之后，Gerstel GmbH公司實現了商品化的磁力攪動吸附萃取棒。從此，SBSE應用于各種水體樣品中痕量有機物的分離和濃縮。它不同于傳統的液液萃取、固液萃取等。SBSE不需要有機溶劑，是一種環境友好型、簡便的萃取技術，特別是在許多易乳化、不均勻的樣品中表現出突出的優勢。

SBSE的解吸有熱解吸與溶劑解吸2種方式。應根據分析對象的物理性質來選擇合理的解吸方法。如果萃取的是熱不穩定、不揮發物質，則采用溶劑解析，再用HPLC分析[5]。

目前，該方法在國外已被廣泛應用到食品[6-7]、環境[8-9]等領域，成為了一種簡便、靈敏的分析技術，而在國內 SBSE的應用還不夠廣泛。本研究采用SBSE萃取煙草揮發性與半揮發性成分，萃取后的攪拌棒放入熱解吸－冷進樣系統（TD-CIS）實現解吸并導入氣相色譜/質譜儀進行檢測。同時還對影響SBSE和Thermal desorption system (TDS）的實驗條件進行了優化，考察了實驗方法的重現性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑、材料

Gerstel Twister攪拌棒（長20 mm，厚0.5 mm），Gerstel TDU-3熱解吸裝置，Gerstel玻璃熱脫附管（4 mm i.d.×178 mm），Gerstel CIS冷進樣系統（德國Gerstel公司）；Clarus 500 氣相色譜-質譜聯用儀（美國Pekin-Elmer 公司）；HP-5MS毛細管柱（0.25 mm i.d.×30 mm×0.25 μm，美國）；恒溫加熱磁力攪拌器（杭州儀表廠JB-007）；AEU-210電子天平（感量 0.0001g，日本島津公司）；B8510E 超聲波振蕩器（上海必能信超聲有限公司）。

自制蒸餾水；乙醇（分析純，上海化學試劑廠）；Na2SO4（分析純，天津試劑一廠）；云南烤煙B3F。

1.2 儀器條件

SBSE萃取條件：萃取溫度為室溫（30 ℃），萃取時間1 h，攪拌速度為1 000 r/min。

熱解吸條件：從20 ℃以50 ℃/min的速率升至250 ℃，保持 4 min，不分流進樣，傳輸線溫度350 ℃。

冷進樣系統條件：采用溶劑排空模式進樣，分流比30:1，冷聚焦溫度為-30 ℃，以12 ℃/s的速率升至280 ℃，保持5 min。

氣相色譜-質譜條件：色譜柱溫 40 ℃保持 2 min，以3 ℃/min升至150 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至250 ℃，保持10 min；載氣為氦氣，流速1.2 mL/min；GC/MS傳輸線溫度為280 ℃；電子轟擊離子源（EI），離子源溫度為 230 ℃，電子能量為70 eV；采用全掃描模式采集數據，質量掃描范圍為30～400 m/z，用NIST02和WILEY7n標準圖譜庫進行數據檢索。

1.3 操作步驟

攪拌棒在使用前夜放入TDS熱脫附管中老化。將煙葉樣品粉碎后過100目篩，稱取10 g樣品于100 mL錐形瓶中，加入30 mL乙醇，超聲萃取30 min后，取上層萃取液2 mL加入到25 mL頂空瓶中，加入18 mL蒸餾水后放入攪拌棒，并密封好玻璃瓶。放入老化好的攪拌棒，在室溫下，以 1000 r/min的轉速磁力攪拌60 min。萃取完成后使用干凈的鑷子將攪拌棒從樣品瓶中取出，用蒸餾水沖洗攪拌棒上的附加物質（如糖、蛋白質及其它臟物）后，放在干燥的棉布上擦干凈，再將干凈的攪拌棒放入玻璃脫附管中部，以便使其均勻加熱，進而達到樣品完全解吸。

2 結果與討論

2.1 萃取條件的優化

2.1.1 攪拌液中乙醇含量 采用超聲法用乙醇對煙草樣品萃取，然后用蒸餾水稀釋乙醇萃取液再進行攪拌棒吸附萃取。實驗中考察了攪拌液中乙醇的體積分數（5%、8%、10%、15%、20%）對攪拌棒萃取量的影響，結果見圖1。可以看出，當攪拌液中乙醇的體積分數小于10%時，隨著乙醇含量的升高，攪拌棒萃取效率（以峰面積計）增加，當體積分數達到10%時，萃取量最大，之后乙醇含量再升高反而降低萃取效率。因此，本實驗確定攪拌液中乙醇體積分數為10%。

圖1 乙醇體積分數對萃取效率的影響Fig.1 Effect of ethanol content on extraction efficiency

2.1.2 萃取時間 萃取時間是影響樣品中各組分從水溶液轉移進入攪拌棒的一個重要因素，達到平衡后再無限地延長萃取時間也沒有實際意義。在室溫條件下，分別稱量相同的樣品，將攪拌速度控制在1000 r/min，萃取時間選取25、35、45、60、70、80 min，獲得不同時間條件下色譜峰面積總和，來確定最佳萃取時間，結果見圖 2。可以看出，隨著萃取時間的延長，在25～45 min內色譜峰峰面積總和迅速增加，60 min后，峰面積增加減緩，最后趨于平穩。考慮到實驗周期和工作效率，將萃取時間定為60 min。

圖2 萃取時間對萃取效率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.1.3 攪拌液離子強度 SPE是SPME和SBSE的理論基礎，因此，離子強度對SBSE的萃取也會產生影響。實驗中分別向樣品中加入不同質量濃度的Na2SO4水溶液（0%、4%、7%、10%），調節樣品離子強度，使待測物溶解度降低。通過比較發現，隨著鹽濃度增加，月桂酸、葵酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸等的峰面積增加，但二氫獼猴桃內酯、鄰苯二甲酸酯、棕櫚酸乙酯、吲哚-2-甲酸乙酯等的峰面積變小。加入Na2SO4水溶液與未加Na2SO4相比較，并未檢測到更多的物質。可見 Na2SO4的加入并不能明顯提高該樣品的萃取效率，同時隨 Na2SO4濃度的增加，多數物質萃取效率反而降低。因此，實驗中選擇不加入Na2SO4。

綜合上述優化實驗的結果，確定SBSE萃取條件為：攪拌液乙醇體積分數為10%，不加Na2SO4，以1000 r/min的轉速攪拌吸附60 min。

2.2 TDS技術條件的優化

萃取棒上所吸附的樣品能否實現完全解吸，關系到實驗結果的準確性。在相同的SBSE條件下，熱解吸溫度（A）、解吸時間（B）和進樣口冷聚焦溫度（C）3個實驗條件是影響被分析物從攪拌棒上轉移至氣相色譜的主要參數。因此，固定SBSE條件，應用正交試驗法，在3個水平上對3個影響因素進行試驗，制定出正交試驗表（表1）。

表1 正交試驗因素－水平表Table1 Factor and level of orthogonal test

實驗結果表明，各因素對實驗結果影響的大小依次為：進樣口冷聚焦溫度＞熱解吸溫度＞解吸時間，即冷肼溫度對實驗結果影響最大。較好的實驗水平組合為A1B2C3，即SBSE在250 ℃下脫附4 min，以-30 ℃的溫度冷肼捕集，得到的被測物質的總峰面積最大。

2.3 樣品分析

按照上述實驗方法，在優化的實驗條件下對該煙草樣品進行測定，得到樣品總離子流色譜圖（圖3），共分離得到 63個組分，經標準譜庫檢索色譜峰分析，結果見表2。表2中采用峰面積歸一化法計算各組分百分含量（各組分峰面積/總峰面積）。定性分析是將未知物的圖譜與NIST02和WILEY7n標準圖譜庫相比較，選取匹配度大于85%（最大值為100%）的作為鑒定結果，共鑒定出32個組分，占總峰面積的97%。從表中可以看出，樣品含有大量的酯類和烯類、酸類化合物，其中酯類占28%、烯類占 19%、酸類占 16%，同時還含有少量醇類（9%）和醛類（6%）等化合物，這些化合物都是特征香氣的物質，能反映該煙草的品質特點。與彭夫敏[10]，胡群[11]報道的煙草揮發性成分鑒定結果相對照，主要物質組成基本一致。

圖3 樣品總離子流色譜圖Fig.3 Total ion current chromatogram of a real sample

表2 樣品主要化學成分及其相對含量Table 2 The major components of real sample and their relative contents

2.4 實驗方法的重現性

分別稱量同一樣品相同質量6份，同一天內在上述確定的優化實驗條件下進行測定。實驗結果表明，32個組分的峰面積的相對標準偏差（RSD）最大的是維甲酸甲酯，為12.3%；最小的是3-羥基-4-甲基苯甲醛，為3%。其中有29個組分的RSD小于10%，平均值為7.5%，說明該實驗方法具有良好的重現性。

3 結 論

本研究采用攪拌棒萃取和熱脫附作為前處理技術，結合氣相色譜/質譜測定了煙草揮發性與半揮發性成分，從樣品中鑒定出 32個不同化學成分，這些物質能反應該樣品的香氣特征。并對影響攪拌棒與熱解吸的實驗條件進行了考察與優化，得到的較優實驗條件是：攪拌棒萃取條件為室溫（30 ℃）下，不加入Na2SO4，以1000 r/min的轉速攪拌吸附60 min；熱解吸實驗條件為從20 ℃以50 ℃/min的速率升至250 ℃，保持4 min，被測組分通過流速為50 mL/min的氦氣轉移到冷進樣系統中進行冷肼聚焦；冷進樣系統實驗條件為采用溶劑排空模式進樣，分流比30:1，冷聚焦溫度為-30 ℃，以12 ℃/s的速率升至280 ℃，將萃取的目標分析物轉移至氣相色譜/質譜中進行分離和鑒定。同一樣品6次測定的不同組分峰面積的RSD平均值小于10%，說明建立的實驗方法重復性較好，與傳統的分析方法相比，分析時間縮短為原來的三分之一，所需樣品量少、靈敏度高，是一種環保、簡便的分析技術。

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