高效液相色譜法測定煙草及煙草制品中的三種水溶性糖

黃 菲，黃翼飛

（廣東中煙工業有限責任公司技術中心，廣州 510145）

煙草中的水溶性糖與煙草的口感、香味特征和焦油生成量關系密切。葡萄糖、果糖和蔗糖是煙草中主要的水溶性糖，是煙草中具有代表性的糖類。

早期主要采用紙色譜法、薄層色譜法及柱層析法等經典方法進行混合糖的分析，這些方法分辨率低、分析時間長、定量測定困難，難以實現自動化操作。

氣相色譜法也可用于對糖類物質的分離測定。氣相色譜法具有選擇性好，靈敏度高等優點。但葡萄糖、果糖和蔗糖等糖的沸點高、揮發性低、難氣化，在進行氣相色譜分析時，需要將這些糖類物質先衍生為可氣化的揮發性成分。但衍生操作步驟繁瑣，耗時耗力，而且對衍生化合物的穩定性難以進行直觀的評判，這些因素都會影響對糖類物質的準確測定。基于這些不足，現在測定單糖和二糖已較少采用氣相色譜法。

對葡萄糖、果糖和蔗糖等糖類的直接測定，高效液相色譜法（HPLC）、離子色譜法（IC）和高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）都有報道，這3種方法分析糖類物質都無需進行柱前衍生化操作。電噴霧離子化技術在高效液相色譜-質譜聯用法對糖類物質進行定量時得到廣泛的應用。HPLC-MS分析糖靈敏度很高，分析速度較快，非常適合對痕量糖類的定性定量分析。由于煙草和煙草制品中的葡萄糖、果糖和蔗糖含量較高，通常無需使用高靈敏度的HPLC-MS法。離子色譜法也較多的應用在對糖的測定中，離子色譜法測糖也可以達到較低的檢測限，適合用于對微量糖類物質的測定。離子色譜法的檢測靈敏度也遠高于對煙草和煙草制品中的葡萄糖、果糖和蔗糖含量的檢測要求，因此進樣前需要對樣品進行較大倍數的稀釋（如稀釋 100倍），且離子色譜法包括柱平衡在內的分析時間較長，平均測試一個樣品需要1.33 h或以上。高效液相色譜法是目前測糖使用最多的方法[1-6]。高效液相色譜法測糖較離子色譜法簡便，測糖穩定性和重復性好，儀器維護簡單，儀器普及率更高，檢測靈敏度完全滿足日常分析的應用要求。

筆者采用以高度交聯的鉛型磺化苯乙烯-二乙烯苯（SDVB）樹脂為填料的陽離子交換色譜柱建立了測定煙草及煙草制品中葡萄糖、果糖和蔗糖的高效液相色譜方法。該方法準確、重復性和再現性好、適用性強。該方法還有一個優點是僅使用無任何污染的超純水作為流動相即可達到理想的分離效果和得到良好的色譜峰形，無需使用乙腈等有毒有害試劑，達到經濟、安全和清潔環保的要求。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

蔗糖、D-(-)-果糖、D-(+)-無水葡萄糖（純度≥99.5%，Sigma-Aldrich公司）；乙腈（純度≥99.9%，MERCK公司）；超純水。

1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配備G1378B脫氣機、G1311A四元泵、G1329A自動進樣器、G1316A柱溫箱和G1362A示差折光檢測器（RID）；Varian Metacarb Pb PLUS色譜柱（300 mm × 7.8 mm）和 Varian Metacarb 87P 預柱柱芯（美國Varian公司）；Milli-Q Element A10 純水機（美國Millipore公司）；HY-5回旋振蕩器（金壇市富華電器有限公司）；CP 224S電子天平(德國Sartorius公司)。

1.2 樣品處理與分析

試驗于 2009年 3月—2010年 9月進行，取1.0000 g煙末，置于100 mL磨口錐形瓶中，準確加入50 mL 0.01 mol/L NaOH萃取溶液，具塞振蕩萃取60 min，經0.45 μm濾膜過濾，濾液進行HPLC分析。分析條件為：Varian Metacarb Pb PLUS色譜柱和Varian Metacarb 87P 預柱柱芯；柱溫箱溫度：80℃；流動相：水，等梯度洗脫；進樣量：20 μL；流速：0.4 mL/min。

2 結 果

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 色譜柱的選擇 示差折光檢測器較多配合使用氨基丙基硅烷為鍵合相的硅膠柱（以下簡稱氨基柱）和陽離子交換色譜柱以及相應的流動相進行水溶性糖類的測定。由于某些煙草和煙草制品樣品的葡萄糖、果糖和蔗糖含量較低，因此，能達到較低的檢測限是色譜柱和流動相選擇的一個重要前提。實驗選用Waters公司的氨基柱（高效碳水化合物卡套色譜柱，4.6 mm × 250 mm，4 μm）和Varian公司的Varian Metacarb Pb Plus陽離子交換色譜柱對比了分析葡萄糖、果糖和蔗糖的檢測靈敏度，結果見表1。其中使用Waters公司氨基柱的優化分析色譜條件[7]為：Sentry高效碳水化合物保護柱和Sentry整合保護柱套（美國Waters公司）；柱溫箱溫度：35 ℃；RID光學元件溫度：35 ℃；流動相：72%（體積分數）乙腈/28%水預混合溶液，等梯度洗脫；進樣量：10 μL；流速：1 mL/min。

由表1可見，使用Varian Metacarb Pb Plus陽離子交換色譜柱和水流動相可以達到很低的檢測限，比使用高效碳水化合物卡套色譜柱和乙腈-水流動相的檢測限低 27倍以上。由于氨基柱在使用的過程中會逐漸流失一些鍵合在硅膠上的氨基堿性基團，這些持續而不穩定的柱流失造成了較大的基線波動，一般基線波動在120 nRIU范圍內（nRIU為示差折光單位的十億分之一）。這些因素造成了使用高效碳水化合物卡套色譜柱測葡萄糖、果糖和蔗糖的靈敏度較低。且由于氨基柱的持續性柱流失，對糖的分離性能下降較快。隨著色譜柱的分離性能下降，對葡萄糖、果糖和蔗糖的保留逐漸減弱，3種糖的色譜峰保留時間會逐漸減少，以至于果糖和葡萄糖無法達到較好的分離。而Varian Metacarb Pb Plus陽離子交換色譜柱的柱流失極小，所使用的流動相水揮發性遠弱于乙腈，檢測基線波動可穩定在5 nRIU范圍內，有利于提高示差折光檢測器的檢測靈敏度。同時，對葡萄糖、果糖和蔗糖可以實現完全的基線分離，而且各糖色譜峰的保留時間很穩定。Varian Metacarb Pb PLUS色譜柱通常使用去離子水作為流動相，經濟、安全、清潔環保，而且方便流動相的隨時更換，無需特別配制。因此，實驗選用Varian Metacarb Pb Plus陽離子交換色譜柱。

表1 高效碳水化合物卡套色譜柱和Varian Metacarb Pb Plus色譜柱測葡萄糖、果糖和蔗糖的檢測限比較Table 1 The comparison of detection limits of glucose,fructose and sucrose on the Carbohydrate High Performance cartridge column and Varian Metacarb Pb Plus column

2.1.2 流速的選擇 流速對色譜柱的分離產生一定影響。高流速可以縮短分析時間，但另一方面也會使柱壓大大升高，而且可能降低目標色譜峰與雜質峰的分離度。Varian Metacarb Pb PLUS色譜柱的最高耐壓為1025 psi，因此實驗選用較低的流速，實驗使用同一標準溶液對比了 0.1、0.3、0.4、0.6 mL/min 4種流速。流速為0.1 mL/min時，果糖出峰時間在101 min，出峰時間過長，且果糖峰高僅為流速為0.4 mL/min時的71%。流速為0.3 mL/min和0.4 mL/min時，3種糖的色譜峰形和分離效果差別不大，與鄰近的雜峰分離干凈，流速為0.4 mL/min的分離時間較短，在27 min內3種糖出峰完畢（圖1）。當流速為0.6 mL/min時，不利于某些樣品的雜峰與目標色譜峰的分離。方法選用流速為 0.4 mL/min。

圖1 果糖、葡萄糖和蔗糖標準色譜圖（A）和煙草樣品色譜圖（B）Fig.1 The chromatograms of fructose, glucose and sucrose of a standard solution and a tobacco sample

2.2 前處理條件的選擇

2.2.1 萃取溶液選擇 0.01 mol/L氫氧化鈉和水是提取煙草中葡萄糖、果糖和蔗糖的常用萃取溶液，兩者對3種糖的提取效率相當。煙草中含有多種酸，煙草樣品的水提取液也呈偏酸性，其中的檸檬酸、酒石酸等酸性物質可催化蔗糖分解[8]，不利于樣品提取液的長時間放置，尤其對于蔗糖含量較高的樣品，蔗糖的分解更為明顯。當使用0.01 mol/L氫氧化鈉進行試樣提取時，稀的氫氧化鈉會中和樣品提取溶液中的酸，使樣品提取溶液呈堿性，可在較長的時間內有效的抑制蔗糖的分解，確保測試結果的真實性。

由表2可見，用水作為提取溶液時，隨著樣品提取溶液在室溫下放置時間的延長，蔗糖含量逐漸減少，放置9.0 h后，蔗糖的測試含量為初始測試含量的65%，放置19.5 h后，蔗糖的測試含量僅為初始測試含量的41%；而葡萄糖和果糖的含量則隨試樣提取溶液放置時間的延長逐步增加。但是3種糖的總量保持一致，平均含量為 27.44%。用 0.01 mol/L氫氧化鈉提取的試樣溶液的3種糖的含量則較穩定，在20 h內3種糖的測試含量保持一致，這樣有利于編制儀器進樣序列對多個樣品進行連續分析。因此，試驗選取0.01 mol/L氫氧化鈉作為提取溶液。

表2 水和0.01 mol/L氫氧化鈉的煙草提取溶液葡萄糖、果糖和蔗糖含量隨放置時間的變化Table 2 The variations of the contents of glucose, fructose and sucrose of tobacco solutions extracted by H2O and 0.01 mol/L NaOH with standing time

2.2.2 提取時間的選擇 選取試樣 A為樣品，按1.2進行樣品處理，把提取時間分別設置為15、30、45、60、90、120 min，結果見圖2。蔗糖在15 min的時候基本提取完全，葡萄糖在30 min時提取量比在15 min時的略有增加，在30 min后則趨于穩定，果糖在60 min時已經基本提取完全。兼顧3種糖在不同提取時間的提取情況，為了保證各糖的完全提取，試驗把提取時間設置為1 h。

圖2 樣品中果糖、葡萄糖和蔗糖在不同提取時間的提取量Fig.2 The extracted contents of fructose, glucose and sucrose of a sample in different extraction time

2.3 標準曲線和檢出限

分別稱取0.25 g葡萄糖、0.25 g果糖、0.20 g蔗糖，精確至0.0001 g，用0.01 mol/L氫氧化鈉溶液溶解后轉入100 mL容量瓶中，用0.01 mol/L氫氧化鈉溶液定容至刻度。得葡萄糖、果糖和蔗糖濃度分別為 2500 μg/mL、2500 μg/mL 和 2000 μg/mL的標準儲備液。再逐級用0.01 mol/L氫氧化鈉溶液稀釋至所需要的濃度。表3為合適的工作標準溶液濃度系列。分別對工作溶液進行HPLC測定，并以各糖色譜峰峰面積（y）對其濃度（x）進行線性回歸分析，得標準曲線回歸方程（表4）。由表4看出，方程的線性良好，相關系數均大于 0.999。檢出限較低為0.002%～0.006%。

表3 工作標準溶液濃度系列 μg/mLTable 3 A series of concentrations of working standard solutions

表4 標準曲線的線性方程、相關系數、檢出限Table 4 The linear equations, correlation coefficients and limits of detections

2.4 方法的重復性

按1.2處理方法對試樣B進行5次平行測定，得方法精密度，以RSD%表示，結果見表5。果糖、葡萄糖和蔗糖的精密度小于 1%，方法的重復性良好。

表5 方法重復性試驗結果Table 5 The test results of the repeatability of the method

2.5 方法的回收率

取樣品B，以其5次平行測定的平均值作為計算其果糖、葡萄糖和蔗糖原始含量的依據（蔗糖、葡萄糖和果糖 5次平行測定的含量平均值分別為1.29%、3.96%和 5.75%），添加高、中、低 3個濃度水平的標準進行回收試驗。由表6可見，果糖、葡萄糖和蔗糖的回收率為98.9%～101.8%，結果理想。

2.6 與離子色譜方法的比對

本方法和煙草行業推薦標準[9]進行了檢測數據比對，結果見表7。兩種方法的測試數值的相對平均偏差均小于5%，一致性較好。

表6 回收率試驗結果Table 6 The test results of recovery

表7 本方法（LC）和離子色譜方法（IC）的測試數據比較Table 7 The comparison of the test data acquired with the constructed method and the ion chromatography method

2.7 煙草和煙草制品樣品的測定

應用本方法對37個不同地區的煙草樣品和36個國內外不同牌號的煙草制品樣品進行分析測定。煙草樣品中烤煙的蔗糖、葡萄糖和果糖的含量范圍分別為0.07%～5.82%、2.78%～13.65%和4.99%～13.36%，白肋煙的蔗糖、葡萄糖和果糖含量極低，3種糖的總含量一般不高于0.2%。煙草制品樣品的蔗糖、葡萄糖和果糖的含量范圍分別為 0.26%～2.33%、1.13%～9.61%和 2.94%～11.00%。大多數煙草和煙草制品以果糖和葡萄糖含量最高，蔗糖含量相對較低。

3 小 結

本方法前處理簡單，重復性好，準確性高，可操作性強，易于推廣。方法只用超純水作為流動相，無需使用乙腈等有毒有害的有機溶劑，清潔環保。

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