Wnt2與β-catenin蛋白在食管癌中的表達特點及病理意義

李 韶，張云慶，徐 飛

(1.鞍山市第四醫(yī)院 內(nèi)科，遼寧 鞍山 114034；2.大連醫(yī)科大學 解剖學教研室，遼寧 大連116044)

食管癌發(fā)生與發(fā)展涉及多基因、多途徑的改變[1-2]。篩選特異敏感的分子指標用于食管癌的人群篩查，將對早期診斷和治療食管癌，降低食管癌罹患及減少患者死亡、延長生存時間均有重要的意義。Wnt/β-catenin途徑是經(jīng)典的Wnt信號途徑，其關(guān)鍵蛋白分別為Wnt蛋白、β-catenin 蛋白等。近年來諸多研究業(yè)已證實，Wnt2及β-catenin 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后不良關(guān)系密切。胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌等癌癥中均已證實上述結(jié)論[3-5]，即Wnt與β-catenin正常表達的罹癌患者，其預(yù)后要優(yōu)于那些Wnt與β-catenin表達上調(diào)的病人。提示W(wǎng)nt與β-catenin表達失調(diào)可作為腫瘤惡性程度以及患者預(yù)后預(yù)測的生物標志物和早期診斷的重要候選分子指標。本研究通過組織芯片免疫組織化學技術(shù)，以癌旁相對正常食管上皮、癌前病變、食管癌組織為研究對象，檢測Wnt2及β-catenin在上述組織中的表達情況和分布特點，分析其表達與食管癌各病理特征之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

9例癌旁相對正常食管組織(癌旁正常組)、38例癌前病變(癌前病變組)及83例食管癌(食管癌組)標本均選自鞍山市腫瘤醫(yī)院1999-2008年未經(jīng)放化療的診斷明確的食管癌手術(shù)切除標本。其中83例腫瘤患者中，男性70例，女性13例，年齡31～78歲，平均年齡(59.8±10.83)歲。鱗癌68例，腺癌15例，高分化27例，中分化40例，低分化16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例。

1.2 實驗方法

石蠟組織制成微陣列，采用免疫組織化學染色(Immunohistochemical，IHC)法，按照SP試劑盒說明書進行免疫組化染色，抗體為山羊抗人Wnt2與兔抗人β-catenin (Santa Cruz，1:100)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判定

染色陽性反應(yīng)為呈現(xiàn)棕黃色顆粒，Wnt定位于細胞漿中，β-catenin在細胞漿及胞核中。判定的標準是：胞漿無著色的為陰性(-)；與未加一抗的陰性對照比較，著色略深的為弱陽性(+)，較深的為陽性(++)，明顯加深的則為強陽性(+++)[6]。其中前二者記為低表達，后二者為高表達。本文將高表達記為表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，應(yīng)用Kruskal-Wallis、Mamm Whitney及相關(guān)性Spearmen的檢驗方法，對Wnt2與β-catenin在不同病變組織中的表達、分布與相關(guān)關(guān)系進行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 Wnt2與β-catenin在不同病變組織中的表達特點

免疫組織化學染色結(jié)果見表1和圖1。從癌旁相對正常組織、癌前病變到食管癌組織，Wnt2表達率分別為22.2%、50.0%和72.3%；β-catenin蛋白的表達率分別為33.3%、47.4%和69.9%，二者均呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，差異有顯著性意義(P<0.05)。食管癌組同癌旁正常組、癌前病變組比較，差異均有顯著性意義(P<0.05)，食管癌癌旁正常組和癌前病變組比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。鱗癌中兩種蛋白表達率(77.9%、75.0%)均顯著高于腺癌(46.7%、46.7%)，P<0.05。

2.2 Wnt2與β-catenin的表達與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Wnt2與β-catenin的表達在性別、年齡、分化程度和病變大小的比較中，差異無顯著性意義(P>0.05)。但兩者在食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達率(86.4%、81.8%)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(56.4%、56.4%) (P<0.05)；侵潤深度 T3、4組表達率(81.0%、82.8%)也明顯高于T1、2 組(52.0%、40.0%)(P<0.05)；Wnt2蛋白表達在臨床I-II期及III-IV期患者標本中分別為62.8%和82.5%,后者顯著高于前者(P<0.05)，β-catenin表達在臨床I-II期(76.7%)高于III-IV期(62.5%)，但差異無顯著性意義(P>0.05)。見表2。

表1 不同病變食管癌組織中Wnt2與β-catenin的表達Tab 1 Wnt2 and β-catenin expression in different EC pathological lesion n(%)

Wnt2 β-catenin圖1 Wnt與β-catenin在不同病變組織中的表達Fig 1 Wnt and β-catenin expression in different tissues

2.3 Wnt2與β-catenin表達的相關(guān)性

Wnt2低表達時，β-catenin也低表達的有42例，高表達有7例；Wnt2高表達時，β-catenin也高表達的有72例，低表達有7例。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析顯示,二者呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05，r=0.740)。

3 討 論

癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)，細胞信號通路的闡明，極大豐富了人們對細胞癌變機制的認識。目前報道中，Wnt途徑異常存在于人類多種腫瘤,如結(jié)直腸腺瘤和癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、肝細胞癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、內(nèi)皮樣卵巢癌、前列腺癌、滑膜肉瘤、髓母細胞瘤等[3-4]。本研究的結(jié)果充分支持了Wnt信號途徑在食管癌中促癌生長、侵襲的作用。Wnt2、β-catenin蛋白在食管癌癌旁、癌前病變及癌組織中的表達率分別從22.2%、33.3%上調(diào)至72.3%、69.9%，差異具有顯著性意義，且Wnt2及β-catenin與食道癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組二者表達率分別為79.5%和81.8%，明顯高于未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(56.6%、56.6%)，浸潤深度侵及漿膜者兩蛋白表達率(81.0%、82.8%)亦顯著高于未侵及漿膜層者(52.0%、40.0%)，這說明Wnt2、β-catenin蛋白可成為潛在的判斷食管癌病變程度以及預(yù)測腫瘤浸潤趨勢的分子指標，具有重要的病理學意義。

Wnt途徑是細胞發(fā)育和調(diào)節(jié)生長的一個關(guān)鍵途徑，不僅在胚胎發(fā)育中，在細胞癌變過程中亦具有重要作用[3,7]。這種變化可由Wnt基因本身或通路中任何成分發(fā)生改變而引發(fā)。Wnt途徑的異常激活大致有以下幾種情況：組成Wnt途徑的蛋白、轉(zhuǎn)錄因子或基因被破壞或變異，導致該途徑關(guān)閉或局部途徑異常活躍；過多Wnt信號使整個途徑異常活躍，細胞進行不必要的增殖；細胞內(nèi)其他因素通過Wnt

表2 Wnt2與β-catenin的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab 2 The relationship between Wnt2, β-catenin expression and clinicopathological agents (n)

途徑來刺激或誘發(fā)細胞乃至機體產(chǎn)生異常反應(yīng)。最終結(jié)果是Wnt 途徑的靶基因組成性激活及細胞增生的失控。Fu等[8]認為間質(zhì)成纖維細胞分泌的Wnt2促進了Wnt途徑的激活從而導致了腫瘤的進展，Sato等[9]的研究則顯示W(wǎng)nt抑制劑在腫瘤免疫治療中作用顯著，而體外SiRNA干預(yù)Wnt表達的實驗顯示腫瘤細胞對化療藥物敏感性有所增強，這些都為腫瘤治療提供了新的方法和思路。

[1] Moyes LH, Going JJ. Still waiting for predictive biomarkers in Barrett's oesophagus[J]. J Clin Pathol, 2011, 64:742-750.

[2] Lordick F. Current standard and trends in oesophageal cancer[J]. Eur J Cancer, 2011, 47: S353-S354.

[3] Buechling T, Boutros M. Wnt signaling signaling at and above the receptor level[J]. Curr Top Dev Biol, 2011, 97:21-53.

[4] Morin PJ, Sparks AB, Korinek V, et al. Activation of β-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in b-catenin or APC[J]. Science, 1997, 275:1787-1790.

[5] Li H, Sun Y, Kong QY, et al. Combination of nucleic acid and protein isolation with tissue array construction: using defined histologic regions in single frozen tissue blocks for multiple research purposes[J]. Int J Mol Med, 2003, 12:299-304.

[6] Agerbaek M, Alsner J, Marcussen N, et al. Focal S100A4 protein expression is an independent predictor of development of metastatic disease in cystectomized bladder cancer patients[J]. Eur Urol, 2006, 50:777-785.

[7] Behrens J, Lustig B. The Wnt connection to tumorigenesis[J]. Int J Dev Biol, 2004, 48:477-487.

[8] Fu L, Zhang C, Zhang LY, et al. Wnt2 secreted by tumour fibroblasts promotes tumour progression in oesophageal cancer by activation of the Wnt/β-catenin signalling pathway[J]. Gut, 2011, 60(12):1635-43.

[9] Sato N, Yamabuki T, Takano A, et al. Wnt inhibitor Dickkopf-1 as a target for passive cancer immunotherapy[J]. Cancer Res, 2010, 70:5326-5336.