硬組織修復材料的骨再生機理研究

鄒學農，陳大福，田 偉，張西正，吳 剛，董 華，周永勝，周光前

(1.中山大學附屬第一醫院骨科研究所，廣東廣州510080)

(2.北京積水潭醫院創傷骨科研究所，北京100035)

(3.中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生裝備研究所，天津300161)

(4.華南理工大學國家人體組織功能重建工程技術研究中心，廣東廣州510006)

(5.北京大學口腔醫院，北京100081)

(6.深圳大學醫學院，廣東深圳518060)

硬組織修復材料的骨再生機理研究

鄒學農1，陳大福2，田 偉2，張西正3，吳 剛4，董 華4，周永勝5，周光前6

(1.中山大學附屬第一醫院骨科研究所，廣東廣州510080)

(2.北京積水潭醫院創傷骨科研究所，北京100035)

(3.中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生裝備研究所，天津300161)

(4.華南理工大學國家人體組織功能重建工程技術研究中心，廣東廣州510006)

(5.北京大學口腔醫院，北京100081)

(6.深圳大學醫學院，廣東深圳518060)

傳統硬組織修復材料由于在組成及結構上與人體骨組織存在較大差異，植入體內后的骨組織修復過程基本上是一種被動的“充填”過程，且材料的降解速度與新骨形成速度不匹配，難以達到真正的“生物性融合”，嚴重制約了該類材料在骨科臨床的推廣應用。因此，設計與制備具有“主動修復功能”和“可調控生物響應特性”的第3代新型硬組織修復材料已成為當前骨科臨床的新需求和未來的發展方向。介紹了硬組織修復材料的骨再生機理研究方法，綜述了硬組織修復材料與宿主防御和骨再生及宿主微環境對材料與宿主細胞相互作用的研究現狀。指出硬組織修復材料植入體內后所發生的序列事件可能通過表觀遺傳修飾使得基因表達受材料本身和宿主微環境等因素的調控，提出新型硬組織修復材料研究中存在的問題和發展趨勢。

硬組織修復材料;骨再生;宿主防御;宿主微環境;表觀遺傳學;基因調控

1 前言

生物醫用材料應用于硬組織修復及功能替代，已有幾十年的時間，如人工骨替代材料、人工關節假體、種植牙等。此類材料在臨床應用中的生物安全性雖然已基本確定，但一些材料與宿主骨結合界面可形成纖維層包裹或界面結合強度低，導致應力遮擋、植入體松動并脫落、植入物失效等問題。20世紀70年代隨著生物玻璃和羥基磷灰石(HA)等硬組織活性材料的研發，人們逐漸認識到植入材料與宿主骨界面能夠通過化學鍵合形成骨性結合，骨組織修復以“爬行替代”方式通過骨傳導作用(Osteoconduction)實現與宿主骨組織的融合［1］。鑒于傳統的第一、二代硬組織修復材料的缺點，有學者提出構建具有離子或分子溶出或利用材料中生物活性分子在基因水平上，激活特定細胞反應的可降解生物活性材料，迅速引起了國內外生物材料研究領域的廣泛興趣［2］。此類具有“主動修復功能”和“可調控生物響應特性”的第三代硬組織修復材料，已成為當前的研究熱點和未來的發展方向。

大量臨床隨訪研究表明，臨床上傳統的硬組織修復材料植入體內后，因其在組成及結構上與人體骨組織存在較大差異，骨組織修復過程基本上是一種被動的“充填”過程，且材料的降解速度與新骨形成速度不匹配，難以達到真正的“生物性融合”、形成牢固的生物學界面，導致植入體在宿主體內一定時間后會發生松動、脫落、老化、腐蝕等現象，嚴重影響硬組織修復的效果。例如，脊柱融合失敗及假關節的發生率高達5%～35%;金屬全髖關節置換10年后的總翻修率高達4%以上。主要原因在于，一方面由于材料植入體內后所引發宿主的炎癥反應、免疫反應、組織再生修復的序列事件并不完全清楚，另一方面宿主微環境(力學、化學、炎癥)對植入材料與宿主組織細胞的相互作用及植入材料在骨再生過程中的轉歸行為等諸多復雜問題尚未完全明了，制約了新型硬組織修復材料的研究、開發和應用。作者在本文中對硬組織修復材料的骨再生機理研究現狀和發展趨勢進行了簡要綜述，同時提出了新型硬組織修復材料設計與制備研究中存在的問題和可能的解決辦法。

2 硬組織修復材料與宿主防御和骨再生體系的相互作用

2.1 硬組織修復材料植入宿主后所發生的序列事件

骨形成有兩種不同的方式:軟骨內成骨和膜內成骨。大部分骨骼如長骨的形成經過軟骨內成骨，即軟骨中間期。少數骨如頭蓋骨的形成僅膜內成骨，即直接從間葉組織的聚集形成骨組織。一般來說，硬組織修復材料植入宿主后，將經歷與正常骨折愈合相似的3個階段，即炎癥期、修復期和塑形期。但由于材料本身及其所介導的宿主防御和骨再生體系的相互作用，硬組織修復材料植入宿主后所發生的序列事件，較正常的骨折愈合過程更為復雜。目前，只有通過動物模型對這一過程進行系統研究，才能弄清硬組織修復材料植入宿主后與宿主防御和骨再生體系的相互作用。

在以往的研究中，系通過建立家豬腰椎前路椎間融合的動物模型，將分別載有馬骨膠原蛋白提取物(COLLOSS?E)、重組人骨形態發生蛋白－2/可吸收性牛I型膠原海綿(rhBMP-2/ACS，INFUSE?)或自體骨的椎間融合器，隨機植入腰3/4、腰4/5、腰5/6椎間隙，術后2周、4周、8周進行磁共振成像(MRI)和正電子發射斷層顯像(PET/CT)掃描，觀察3種不同材料在脊柱融合炎癥期、修復期和塑形期所發生的動態變化;動物處死后取標本進行顯微CT掃描、組織學與組織形態計量分析，提取總RNA進行基因表達譜芯片和microRNA芯片檢查。結果顯示，3種不同材料在脊柱融合過程中骨形成的表現方式不同，如COLLOSS?E和自體骨移植呈現軟骨內成骨，而rhBMP-2促使類骨質直接沉積于膠原網絡表現為膜內成骨［3］;3種不同材料在脊柱融合過程中所形成的新骨三維結構也有明顯區別，且不同材料移植早期發生的炎性水腫、組織腫脹、新骨形成過多等不良事件的程度不同［4］;3種不同材料植入宿主后與不同階段的炎癥反應與免疫反應如自然殺傷細胞介導的細胞毒性作用、抗原提呈相關通路、T細胞受體通路及Toll樣受體通路等呈現時序變化規律且相互重疊;3種不同材料在脊柱融合過程中，經不同的成骨方式促使脊柱融合的分子事件也不同，如在炎癥期rhBMP-2明顯上調PGHS-2，IGFBP-2和IGF-2等多種因子表達誘導骨前體細胞募集、增殖與分化導致膜內成骨，在塑形期明顯上調釉原蛋白基因促進骨塑形;而COLLOSS? E(主要為I型膠原蛋白)和自體骨在炎癥期下調血管內皮細胞生長因子(VEGF)基因表達抑制成血管作用，從而減少BMP誘導的膜內成骨，在修復期上調募集的間充質干細胞(MSCs)成軟骨分化相關基因CTGF與 COMP表達和基質礦化相關基因MGP與COL10A1表達引起軟骨內成骨［5］;作為一類重要的轉錄后基因表達調控因子，miRNA參與了脊柱融合過程中廣泛的生物學過程，3種不同材料植入體內后所發生的分子序列事件的特異性基因表達受miRNA的調控，這些miRNA包括miR-181c， miR-363， miR-140， miR-224， miR-99b， miR-935，miR-455，miR-10a，miR-29c，miR-486，miR-127，miR-206，miR-19a，miR-450c等(未發表數據)。由此可見，硬組織修復材料植入宿主后所介導的宿主防御和骨再生過程，涉及炎性反應、免疫反應、血管生成、骨前體細胞遷移、增殖與分化、成骨細胞與破骨細胞活動等宿主體內應答的序列事件，將啟動一系列復雜的信號傳導通路網絡調控和表觀遺傳學機制，實現骨組織再生修復或導致植入物失敗(圖1)。

表觀遺傳學是研究非DNA序列變化的、可遺傳的、影響基因表達的科學，表觀遺傳學機制參與個體發育、干細胞分化等許多生物學過程以及表觀遺傳學機制(DNA甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑、miRNA等)的調控。在成骨模型中，Rb(Retinoblastoma)蛋白作為協同轉錄因子，可以增強Runx2的轉錄活性，從而促進成骨［6］，H3K4去甲基化酶視網膜母細胞瘤結合蛋白2(Retinoblastoma Binding Protein 2，RBP2)可以拮抗Rb而抑制成骨細胞分化［7－8］。最近研究發現，RBP2依賴于其組蛋白去甲基化酶活性抑制重要成骨轉錄因子Runx2的功能，從而削弱了人脂肪間充質干細胞(hASCs)向成骨細胞分化的能力［9］。同時還發現單胺去氧化酶家族類的去甲基化酶LSD1與Runx2物理上存在相互作用。體內外試驗表明，LSD1的功能缺失顯著促進了hASCs的成骨向分化，提示LSD1、RBP2如組蛋白修飾所介導的表觀遺傳機制，可能在hASCs的成骨向分化中有著重要作用。因此，采用表觀遺傳學理論和技術，研究硬組織修復材料對細胞生長分化以及組織再生修復序列事件的影響，能更深入全面地揭示硬組織修復材料在骨再生過程中的表觀遺傳學機制。

圖1 骨修復材料植入宿主后宿主防御與骨再生體系的相互關系Fig.1 Relationship between host defense responses and bone regeneration system after the implantation of bone repair materials

2.2 硬組織修復材料與干細胞的相互作用

如前所述，不同材料植入宿主后MSCs募集、增殖與分化事件出現的時序不同，導致了骨形成方式的不同。因此，新型硬組織修復材料在設計之初，就需要考慮是否真正具備誘導骨再生的能力，該類材料與干細胞的相互作用被認為是導致骨再生的一個重要因素，而體外評價是可靠實用的實驗研究方法。Levenberg等［10－11］體外培養證實干細胞接種于支架材料，能促進干細胞發揮其生物學功能，通過支架材料表面生物學功能的模擬，可在體內外誘導組織或器官的形成。例如，RGD序列為人纖維連接蛋白(Fibronectin，FN)與其受體的結合位點。采用RGD序列修飾聚合物三維支架表面，可改善細胞在材料上的粘附［12］、介導FAK-PI3K-Akt信號傳導通路參與聚已內酯(Polycaprolactone，PCL)三維支架材料表面與骨髓MSCs的相互作用［13］;而整合素-α修飾的BCP/PCL-nHA三維支架表面，可激活ERK信號傳導通路，在誘導脂肪干細胞成骨分化中起著重要作用［14］;在PCL三維支架表面自組裝透明質酸、甲基膠原與共聚物復合膜，可改善干細胞在支架材料內的接種效率、分布與成骨分化的能力［15］。此外，三維支架材料的孔徑也影響與干細胞的相互作用，如孔徑200 μm珊瑚羥基磷灰石加速hMSCS成骨分化，但孔徑500 μm珊瑚羥基磷灰石增加細胞增殖率與細胞數［16］。而三維結構較二維結構更易感受壓力信號而激活p38、JNK信號傳導通路，誘導接種于磷酸鈣(CP)支架材料中胚胎干細胞向成骨分化［17］;金屬Ti表面微結構通過Wnt信號分子(Dkk1和Dkk2)和信號傳導通路(Wnt/Ca2+)影響干細胞成骨分化和成骨細胞成熟［18－19］。由于不同硬組織修復材料本身的組成、形態結構、孔徑與孔隙率、表面及機械強度等獨立信號千差萬別，因此，建立新型硬組織修復材料的干細胞分化快速篩選平臺，在基因水平上篩選具有激活特定干細胞向成骨細胞分化的材料學因素，將有利于加速新型硬組織修復材料的設計、開發和應用。

2.3 建立新型硬組織修復材料的干細胞分化快速篩選平臺

硬組織修復材料與干細胞的相互作用，促使生長因子整合和細胞粘附［10－11］。除 BMPs和 TGF-β 外，涉及低氧誘導因子-1(Hypoxic Inducible Factor-1，HIF-1ɑ)，FGF，Wnt，Notch，hedgehogs，FGF，IGFs，基質細胞衍生因子-1(SDF-1α)/CXCR4等多重信號通路及其下游信號分子的復雜調控網絡，最終激活成骨分化特異性轉錄因子Runx2和Osterix(Osx)等關鍵轉錄因子，參與調控MSCs及骨前體細胞分化和骨形成［20－22］。軟骨內成骨和膜內成骨都需要Runx2的參與，MSCs向成骨細胞分化受Indian Hedgehog(Ihh)，Runx2，Osx和 Wnt/β-catenin信號通路等各種轉錄因子和信號蛋白調控［23］。Ihh屬于Hedgehog家族，它對軟骨內成骨和Runx2的激活是必需的［24］。Runx2參與 MSCs向骨前體細胞分化［25］。Osx是Runx2的下游基因，在成骨細胞表達但在前肥大軟骨細胞中的表達，Osx在骨前體細胞分化為成熟的成骨細胞中起關鍵作用。Osx敲除胚胎能形成軟骨但無骨形成及成骨標志基因如骨鈣素、骨唾液酸蛋白、堿性磷酸酶等的表達［26］。Wnt信號通路實際上涉及多個細胞受體和配體分子，其主要下游信號分子β-Catenin在成骨分化的不同階段起不同甚至相反的作用，而Osx能抑制Wnt信號通路及其下游特異性基因的表達，參與骨形成的負反饋調控途徑［20］。因此，Osx被認為是控制成骨細胞分化的分子開關，缺乏Osx的激活將無新骨形成［20，26］。隨著對干細胞向成骨細胞分化與Osx及其下游靶標和信號通路研究的不斷深入，將有助于建立新型硬組織修復材料的干細胞分化快速篩選平臺。

3 硬組織修復材料與宿主微環境的相互作用及轉歸

硬組織修復材料與宿主微環境之間復雜的相互作用，趨向一個主動修復過程，可能受宿主微環境因素如力學微環境、炎癥微環境和化學微環境(如pH值、氧分壓等)的影響或作用，也受到材料在組織再生過程中轉歸行為的影響。

3.1 硬組織修復材料與宿主微環境和宿主細胞的相互作用

3.1.1 力學微環境對硬組織修復材料與骨骼細胞功能的影響

力學微環境是生物體硬組織所必需的，骨組織的力學微環境是流體、應變耦合的物理條件，對骨組織形成的細胞網絡中MSCs、骨祖細胞、成骨細胞、破骨細胞和骨細胞均有重要影響。研究發現，接種于靜電紡絲PCL三維支架中的成骨細胞經10%壓縮應力刺激后，成骨相關蛋白(BMP-2、骨鈣素)和骨基質相關蛋白(骨橋蛋白、骨連接蛋白)或基因的表達均上調，細胞外基質(Extracellular Matrix，ECM)也較對照組增多，支架的彈性模量也比無細胞支架增加了約5倍［27］。成骨細胞－聚氨酯(Polyurethane，PU)三維支架復合物經1Hz、5%的壓縮應力刺激后，膠原、鈣含量顯著增加，支架復合物硬度增強［28］。Dumas等向人骨瘤細胞－羥基磷灰石三維支架復合物施加3Hz、5N(1μm)的壓縮應力刺激，發現膠原和FN微弱上調，但細胞－支架復合物經25Hz壓縮刺激后，膠原和FN顯著上調;另外，較高頻率的壓縮刺激可增加支架ECM結合VEGF的量［29］，可能有利于血管化。Sittichockechaiwut等向成骨樣細胞MLOA5/PU多孔支架施加周期性壓縮應力，發現細胞骨特異性基因/蛋白表達顯著上調，骨礦化基質的形成也明顯增多［28］。上述研究雖涉及體外載荷作用下生物活性材料與細胞復合體的轉歸行為，但體內力學微環境對生物活性材料/細胞復合體影響還遠未闡明。

力學載荷對骨骼細胞功能的影響，是通過多重信號通路網絡的相互作用來調控的。成骨及破骨細胞對應力環境的響應，導致細胞內一系列生化事件的級聯放大效應，包括蛋白質的修飾(主要是磷酸化)、蛋白質與蛋白質的相互作用、以及下游靶基因表達的改變等。作者采用基因芯片與蛋白質組學高通量篩選技術，研究力學載荷對成骨細胞、破骨細胞的影響，生理載荷作用下，發現1 992個差異表達的基因，涉及123個信號傳導通路的改變;超生理作用下，發現1 435個差異表達的基因，涉及101條信號傳達通路的變化，骨密切相關的近30條信號傳導通路(未發表數據)與文獻報道［30］一致。應用SELDI-TOF MS技術(又稱蛋白指紋圖譜技術)篩選結果顯示，有41種蛋白質在應力作用下，發生了明顯、穩定的質和量的改變，經質譜鑒定實際有37種蛋白質發生變化，其中明確與骨生長發育相關的蛋白質有12個。上述結果表明，力學載荷對成骨細胞、破骨細胞、骨細胞具有重要影響，但在力學作用下硬組織修復材料與骨骼細胞功能的影響有待進一步研究。

3.1.2 炎癥微環境對硬組織修復材料與骨骼細胞功能的影響

炎癥微環境對細胞的影響非常復雜，涉及多種炎癥因子介導的信號通路激活或抑制，是細胞生物學行為改變的關鍵因素。其中，重要的炎癥因子包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1、6(IL-1、IL-6)等。TNF-α可激活T細胞，促進其他炎癥因子的分泌，從而誘發炎癥反應。TNF-α和IL-1等可快速激活細胞核因子NF-κB通路，活化的NF-kB進入細胞核內與基因啟動子區域的固定核苷酸序列結合而啟動基因轉錄，參與炎癥與免疫反應［31－33］。而炎癥微環境對生物修復材料－細胞復合體成骨分化和硬組織再生影響的研究，則基本屬于空白。

3.1.3 化學微環境對硬組織修復材料與骨骼細胞功能的作用

低氧環境對多種類型細胞的分化和基因表達產生影響，而骨折后血腫區域由于供血不足會在區域內造成低氧，并促進釋放大量細胞因子。這種低氧環境對骨折區域骨再生可能存在影響。Brusselmans K等的實驗證實，低氧可以促進胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells，ES)表達VEGF，從而促進細胞的存活，而抑制VEGF基因的表達，則在48 h的低氧培養中，ES細胞凋亡增加了10倍［34］。同時低氧環境會促進細胞表達HIF-1，繼而誘導缺血組織大量表達SDF-1，從而促進血液循環中的干細胞向缺血處歸巢，進而促進血管形成。比如Yamaguchi J等利用小鼠模型研究發現，在缺血組織中SDF-1能促進內皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)的歸巢［34］。另外，有學者利用Akt基因修飾的MSCs植入缺血組織，發現MSCs的存活率也明顯較高，但是，VEGF通過怎樣的機制促進干細胞耐受低氧，以及與相關信號通路網絡的關系尚不清楚［35］。HIF-1ɑ通路調控的下游基因多達到100個，除主要通過VEGF調控血管生成外，也參與多種細胞的存活、增殖、遷移和能量代謝等重要過程。但低氧環境對MSCs向成骨分化的影響，目前沒有確切的結論。

以高分子聚合物作為硬組織修復材料的降解過程，可引起宿主微環境pH值的變化。如聚乳酸－羥基乙酸共聚物(Poly Lactic-co-Glycolic Acid，PLGA)在體內降解后，使局部微環境酸性增加，會引發細胞分泌促炎癥因子和內質網應激(ER Stress)，誘發細胞凋亡。在這個過程中，內質網膜蛋白 BI-1(BAX Inhibitor-1，BI-1)和MAPK信號傳導通路起了關鍵的作用。BI-1是一種pH值依賴的鈣通道蛋白，可在酸性環境下促進Ca2+釋放，促炎癥因子積聚，內質網應激，進而激活MAPK信號通路，表現為細胞內磷酸化JNK水平激增，誘發細胞凋亡［36］。

3.2 硬組織修復材料在骨再生過程中的轉歸行為

硬組織修復材料在組織再生過程中的轉歸行為，受宿主微環境、宿主細胞以及材料本身諸多因素的影響，其具體的轉歸機制尚不十分清楚。正常骨組織處于持續的力學作用下，模擬在體環境、且伴有模擬生理溶液(SBF)的流動，來研究力學載荷對硬組織修復材料的轉歸行為是很重要的。Yang等［30］采用熱致相分離/粒子洗脫法，制備PLGA和 PLGA/磷酸三鈣(β-TCP)多孔支架，比較了動態和靜態載荷條件下三維支架的降解行為。結果表明，循環壓載荷明顯加速了兩種三維支架的降解且復合成骨細胞的增殖受其影響。Kang等［37］的研究得出，動態載荷促進PLA/β-TCP三維支架的體外降解。Rolda等［38］將 BMP7/BCP陶瓷支架材料復合 MSCs植入小鼠體內12周后，發現材料被降解并有新骨形成，支架材料中未與新骨接觸部分的降解程度較高。Jiang等［39］發現殼聚糖-PLAGA熔結的三維支架，在體外較PLAGA降解慢;前者固定上肝素和BMP-2后植入兔體內更能促進新骨形成，后者也能以膜內成骨方式形成新骨組織。上述研究揭示了一些生物活性材料或生物材料－細胞復合物在體內外的轉歸行為，但遠未闡明硬組織修復材料內，新生組織形成與材料降解的關系以及降解產物在體內的分布、聚集和代謝等過程。

盡管已有學者對聚苯乙烯乳膠納米微球，在體內的分布、蓄積及代謝引起的機體反應［40］與碳納米管激發機體的免疫應答［41］進行了研究，但納米生物活性材料在體內是可降解的，機體對其的響應可能與其在體內的降解速度及Ca，P離子在細胞、組織的蓄積濃度有關。目前對生物活性材料的納米粒子在細胞、組織、器官的轉歸及機體應答，還缺乏全面科學的認識。因此，有必要深入開展該領域的研究工作，闡明納米生物活性材料與機體的相互作用機理，對指導納米生物活性材料的設計、組裝開發出新型硬組織修復材料有重要的意義。

生物陶瓷降解溶出的Ca，P離子的一部分，可為局部新生骨組織利用，其他通過組織液、血液帶到全身。硬組織修復材料摻雜的一些微量金屬元素的溶出，可直接參與細胞代謝、分裂、生長等生理過程。生物活性玻璃中含有的微量Si，是有機體內必需的微量元素，生物玻璃降解過程中釋放的Si，對成骨是有益的。例如，Si的補充顯著增加了去勢大鼠股骨和脛骨的骨密度［42］，Si和Ca對去勢大鼠骨質疏松具有交互作用，在Ca攝入不足時，Si的補充能增加脊柱、股骨和脛骨的骨密度［43］。在骨骼生長發育過程中，Zn缺乏可引起骨的生長遲緩，甚至骨骼畸形。適量的Zn可促進骨生長及鈣化，體內外實驗發現Zn能抑制破骨細胞的形成，從而抑制骨吸收［44－45］。

另一方面，脂肪族聚酯作為生物醫用高分子材料，在臨床應用已有30年的歷史，大部分研究集中在體外環境中模擬高分子材料的降解行為［46］，對于體內環境下降解行為及機理的研究較少。現有的動物體內實驗，多集中在觀察材料結構及外觀形貌變化、質量損失及一定時期內降解產物對于周圍組織的影響上［47］。目前最大的問題，就是對于高分子材料在體內降解過程中炎癥與免疫反應的序列事件和機理尚不明確;而對于不同降解階段降解產物的分子量大小及分布，在不同組織器官內的分布規律，有無蓄積傷害及代謝途徑都沒有系統的研究。如何針對不同的植入環境，篩選出影響降解行為變化的關鍵因素，最終在設計層面達到優化，是制備降解行為與組織再生過程相匹配的硬組織修復材料一個亟待解決的問題。

綜上所述，宿主微環境中物理、化學、生物學因素對硬組織修復材料的降解和轉歸影響巨大。因此，建立能模擬宿主微環境的體外研究平臺，篩選出影響硬組織修復材料轉歸行為的材料學、宿主微環境和生物學關鍵因素，最終在設計層面達到優化，制備出降解行為與組織再生過程相匹配的新型硬組織修復材料，將為新型硬組織修復材料的優化設計提供科學依據。

4 新型硬組織修復材料的功能化設計及其生物學效應

硬組織修復材料在臨床上應用較為廣泛的生物活性材料，包括羥基磷灰石(HAP)、磷酸三鈣(TCP)、生物活性玻璃等［48］。這些材料與傳統的生物惰性材料在化學成分上有顯著差異，在骨再生能力上有了質的突躍。生物活性玻璃作為生物活性材料中的重要種類，由于其特有的無機非晶態化學結構、基因激活特性及促進生物礦化等優異性能，被認為是一類具有比其它結晶態生物活性材料更為優越的硬組織修復材料，近年來越來越多地受到國際生物材料學界的關注。體外實驗表明，溶膠－凝膠生物玻璃在模擬生理溶液(SBF)中釋放出可溶性Si及Ca離子的速度及形成低結晶度的HCA的速度，均高于熔融法生物玻璃［49］，顯示溶膠－凝膠生物活性玻璃，在調控成骨細胞增殖、分化上具有良好的應用前景。

長期以來，國內外對材料的化學結構、微－納米結構、表面拓撲形貌等對細胞的遷移、粘附、增殖和分化的影響方式與規律進行了大量的研究。這些材料的結構性能，可通過多種途徑激活細胞相關受體、基因表達以及信號通路網絡等，來調控細胞學行為，如生物活性化學基團直接與細胞膜表面受體相互作用，通過介導材料表面吸附蛋白調控細胞行為，以及通過溶出成分或降解產物來調控細胞行為［50－53］。而功能性小分子對細胞特異功能的調控提供了另一種可供選擇的途徑［54－56］，同時，也為材料結構的功能化設計提供了可行性。目前已發現一些具有抗炎、促進成骨細胞分化和血管生成能力的天然功能小分子，如Ginkolide B可通過激活內皮祖細胞Akt及MAPK/p38通路，提高其粘附、遷移和增殖以及體外成血管分化能力［56］。Icariin能促進MSCs成骨分化，上調成骨相關基因 COL1a2、BMP-2、OSX和RUNX-2等的表達，能促使成骨細胞成熟、礦化，抑制破骨細胞，減慢骨吸收過程［57－59］。Quercetin，Curcumin，Ursolic acid等小分子表現出抗炎特性，也為未來在修復材料結構上設計抗炎功能提供了多種可供選擇的分子［60］。點擊化學是最近10年來出現的重要現代化學合成方法，提供了將上述小分子修飾到材料結構單元上的良好途徑，通過簡單高效的反應，來實現具有新型功能的分子結構，受到了有機化學、藥物化學、生物大分子化學以及功能高分子材料化學研究人員的高度重視［61］。通過點擊化學在可降解有機高分子側基上便利地引入活性功能小分子，結合對可降解高分子的結構設計，能夠實現在高分子結構預設的可降解性能、彈性模量及生物學功能性能。

目前，納米結構與納米尺度對細胞粘附、遷移、增殖及分化的影響，同樣也引起了研究人員的廣泛興趣。許多研究者報道了不同微納米形態結構調節硬組織修復材料生物活性的分子機制［62－63］，但納米材料的生物毒性需重點關注。研究表明，納米金顆粒能夠通過吸附血漿中的某些蛋白，激活細胞的p38 MAPK途徑，在啟動成骨分化的同時，抑制間充質干細胞向脂肪細胞分化［64］。在可降解聚羥基烷酸酯中添加45S5生物玻璃成分，提高了復合材料表面的生物活性，有利于形成類骨羥基磷灰石的沉積，同時，促進細胞的粘附、增殖、堿性磷酸酶活性及骨鈣素分泌［65］。在生物玻璃陶瓷(Bioverit II)上制備出具有納米結構的硅表面涂層，動物實驗顯示增強了成骨效應，同時抑制了炎癥細胞在材料表面的粘附［66］。上述研究讓人們看到了納米結構與納米材料正向作用的應用前景，進一步深入研究其調控細胞行為的途徑與分子機理研究，對如何設計新一代具有高生物安全性，同時具有特定生物學功能的硬組織修復材料，具有重要的指導意義。

隨著多種微加工新方法的出現，對材料相關表面拓撲物理、化學圖案及其尺寸的細胞生物學效應的研究報道逐年增多。表面形態結構如材料表面的粗糙度、不同的表層微觀形貌結構如凹槽型、山脊型、孔洞型、孔洞的大小及分布等，都對細胞形態、粘附、鋪展、遷移、定向生長有很重要的影響［63，67－68］。近年來發展起來的二維細胞圖案化技術［69］，為藥物分子檢測及研究材料表面界面生物活性分子調控細胞學行為的機制和特性［70－71］提供了重要的工具。例如，將圖案化的金膜共價接枝到PEG水凝膠表面，用以固定MSCs從而形成材料表面干細胞的圖案化結構。通過改變干細胞圖案的形狀和大小，可改變與干細胞之間相互作用從而影響干細胞分化［72］。采用電化學方法在鍍有金膜的表面吸附硫醇單分子層，將細胞流經圖案化的聚合物微通道，實現了在金膜表面指定區域的固定［73］。

隨著納米合成及控制技術，相關微加工、微刻蝕等新技術的不斷發展，利用微納結構與形態調控細胞行為，將超越化學成分與結構調控的局限性，大大拓展可用的方法與手段。美國康奈爾大學的March等利用生物微加工技術，制備出三維絨毛狀的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)和膠原，作為人工腸絨毛，研究上皮直腸癌細胞在材料表面的粘附、鋪展、增殖和分化，以及癌細胞對材料釋放藥物的響應［74］。麻省理工學院的Langer教授課題組，將聚癸二酸丙三醇酯加工成三維圖案化的薄層后，通過熱壓方式層層疊加構建了具有特定通道網絡結構的生物活性材料，并研究了肝細胞在其中的細胞學行為［75］。利用微結構調控細胞學行為，已經成為生物材料研究人員進行材料結構設計必須認真考慮的環節。

在宏觀結構的大尺度上，硬組織修復材料的內部孔徑結構、孔隙率、孔的聯通特性，多級結構的結構效應，將能夠更好地實現細胞的遷移與組織的修復，不僅對修復過程中營養成分的輸運、代謝產物及降解產物的排除、細胞向材料內部的遷移通道、血管在材料內部的分布方式、細胞聚集形成的細胞學行為等均有直接的影響，對成骨細胞的分化調控都會產生直接的效應。而新型成形制備技術如微區圖案技術、顯微刻蝕技術、三維打印技術、電仿絲技術、快速成形技術、梯度材料結構控制技術、一體化構建技術等，將成為未來組織修復材料的主要成形加工技術，綜合應用多種先進制造技術手段，使得實現具有復雜空間可控結構的實現更為容易，最終形成預設形狀、結構、強度、表面與空間分布的化學及生物學環境的硬組織修復材料［19，72，74－75］。

綜上所述，未來圍繞人體硬組織缺損修復所涉及的關鍵科學問題，開展材料學、生物醫學工程、生命科學、臨床醫學等多學科交叉、協同研究，從以下4個層面來設計和構建結構－功能可調控的新型硬組織修復材料:①分子結構層面。主要決定材料的基本性質，包括生物活性、生物相容性、可降解性和材料具有的特殊功能(如成骨、成血管、抗炎、抗免疫等);②納米結構層面。調節與其相接觸細胞的粘附、鋪展與基因表達過程;③微米結構層面。決定材料及其周圍孔隙的形態結構、大小和微觀界面性質，主要調節細胞在界面的特異性吸附，細胞的遷移與定向生長;④宏觀大尺度層面。決定修復組織總的形狀和大小以及材料的整體性能。從材料組成、微納結構和宏觀性能上，對不同層次結構與細胞相互作用的分子生物學機制進行深入研究，尋找能夠促進成骨、成血管、協調體內炎癥及免疫的良好微觀及宏觀結構，進而指導新型硬組織修復材料的設計和制備，將可提升我國在該領域的自主創新能力，促進具有我國特色和自主知識產權的第3代生物醫學材料和產品開發。

5 結語

硬組織修復材料植入體內后所引發宿主的炎癥反應、免疫反應、組織再生修復的序列事件并不完全清楚，另一方面，宿主微環境(力學微環境、化學微環境、炎癥微環境)對植入材料與宿主組織細胞的相互作用及植入材料在骨再生過程中的轉歸行為等諸多復雜問題尚未完全明了。因此，進一步開展硬組織修復材料的骨再生機理研究，深入探討硬組織修復材料與宿主防御和骨再生體系的關系，以及宿主微環境對植入材料與宿主組織細胞的相互作用及材料轉歸行為的規律，探索硬組織修復材料在體內轉歸過程中，組織適配、力學適配和降解適配機制，揭示硬組織修復材料植入體后所發生的序列事件，受材料本身和宿主微環境等多因素影響的表觀遺傳學機制與信號傳導網絡調控的分子機理，進而指導在材料的分子組成、微－納結構和宏觀性能設計層面上優化、制備出具有“主動修復功能”和“可調控生物響應特性”的新型硬組織修復材料，從而加速我國新型硬組織修復材料與產品的設計、開發和應用。

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Bone Regeneration Mechanism of Advanced Biomaterials for Hard Tissue Repair

ZOU Xuenong1，CHEN Dafu2，TIAN Wei2，ZHANG Xizheng3，WU Gang4，DONG Hua4，ZHOU Yongsheng5，ZHOU Guangqian6
(1.Orthopaedic Research Institute，First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China)
(2.Beijing Traumatological Orthopaedic Research Institute，Beijing Jishutan Hospital，Beijing 100035，China)
(3.Research Institute for Medical Equipment，Military Medical Science Academy of the PLA，Tianjin 300161，China)
(4.National Engineering Research Center for Human Tissue Restoration and Resconstruction，South China university of technology，Guangzhou 510006，China)
(5.Beijing University Hospital of Stomatology，Beijing 100081，China)
(6.Medical school of Shenzhen University，Shenzhen 518060，China)

Traditional biomaterials for hard tissue repair in composition and structure are hugely different with human bone tissue.The repairing process of these materials is basically a passive“filling”process when implanted in the body.Because new bone formation and material degradation rate do not match well enough，it is difficult to achieve the real“biological fusion”，and this restricted the use of materials in orthopaedic clinical application.Therefore，design and preparation of advanced third generation biomaterials for hard tissue repair with“active repair function”and“controlled biological response characteristics”has become the new demand of orthopaedic clinical application and future research direction.This paper introduced main research methods for bone regeneration mechanisms of advanced biomaterials for hard tissue repair，and it also summarized the current research results of interactions between these biomaterials and host cells in host microenvironment，and interactions between the biomaterials and host defense responses in the process of bone regeneration.These sequential events after the implantation of advanced biomaterials for hard tissue repair are apparently controlled by gene regulation，which is possible to be modified by a series of epigenetic mechanisms with many factors such as material itself and host microenvironmental factors.This paper puts forward new problemsexisted in theresearch of advanced biomaterials for hard tissue repair and development trend.

biomaterials for hard tissue repair;bone regeneration;host defense;host microenvironment;epigenetics;gene regulation

R318.08

A

1674－3962(2012)09－0040－10

2012－04－16

科技部973計劃項目(2012CB619100);國家自然科學基金資助項目(30571892)

及通信作者:鄒學農，男，1964年生，教授，博士生導師

10.7502/j.issn.1674－3962.2012.09.06