蛋白質組學在骨質疏松癥大鼠頜骨組織差異蛋白篩選和鑒定中的應用*

李伯翰 劉洪臣 鄂玲玲

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是目前世界上發病率較高的疾病之一，世界衛生組織WHO已把OP列為中老年三大疾病之一。目前，我國OP患者約9000萬，約占總人口的7.1%，隨著社會老齡化的進程，其發病率呈上升趨勢，預計到2050年將增加至2.21億。OP可引起疼痛、骨骼變形、骨折等系列病發癥狀。骨質疏松時，頜骨骨密度下降，生物力學性能降低，致使牙周炎及牙槽嵴加速吸收，在種植牙方面，可降低種植體的骨結合率、延長種植體骨結合的時間，導致種植的失敗。由于受牙、牙周和咀嚼習慣等因素等局部影響，頜骨骨質疏松骨質喪失有其自身的特點。因此，對OP大鼠頜骨組織蛋白表達的影響及相關機制的研究，有助于探尋頜骨骨質疏松的發病機理，檢測相關的治療方案，預測治療效果。本文就蛋白質組學在骨質疏松癥及骨質疏松癥頜骨相關蛋白表達的研究進展作一綜述。

1.頜骨骨質疏松實驗動物模型的建立

建立OP實驗動物模型是OP病因學與治療學中不可缺少的研究平臺。OP模型的選擇應盡可能模擬臨床人類OP的形成機制和特征，且要求觀測指標穩定，重復性高。OP病理模型的方法很多，主要包括去勢法、低鈣飲食法、維甲酸法、糖皮質激素法、廢用性骨質疏松法[1-3]。去勢法是通過切除動物雙側卵巢造成雌激素的缺乏而形成骨質疏松，可以較好地模擬絕經后OP的骨代謝特點及臨床癥狀。卵巢切除后，雌激素水平迅速下降，骨吸收大于骨形成，骨量減少，骨強度下降。而且作用因素單一、模型確認、重復性好，己成為標準化的絕經后OP經典病理模型，在研究中被廣泛應用，也是美國FDA和WHO推薦的模擬婦女絕經后骨質疏松的最佳動物建模方法[2]。但去勢法的造模時間相對長，而低鈣飲食法恰恰可以縮短骨質疏松造模所需的時間。所以國內外學者，也常將去勢法和低鈣飲食法結合使用，成為OP常用的造模方法。

OP型常用動物有大鼠、家兔、山羊、狗、猴等[1-5]，其中大鼠在OP的實驗研究中應用最為廣泛。研究者在制備去勢模型時，常選用3-6月齡大鼠[4]。此時的大鼠性成熟不久，雖然可較快地復制出OP模型，但由于基本生理條件僅能代表年輕機體，與臨床絕經后骨質疏松的發病過程不盡吻合[6]而人類OP多在中年后期發生，故采用中老年大鼠可以復制出較為符合臨床特征的動物模型[7]。關于造模后骨質疏松形成的時間，有研究報道[8]3月齡大鼠去卵巢后約50d，骨質疏松模型能夠可靠形成。也有資料報道[9]雌性大鼠切除雙側卵巢后4周，骨密度、骨強度和骨鈣含量才均明顯低于空白對照組，因而認為4周后骨質疏松模型才形成。大鼠去卵巢4周后雌激素水平下降，促黃體素和促卵泡素水平上升[10]，骨代謝發生異常改變，破骨細胞骨吸收活動加速，骨轉換率增高(骨吸收超過骨形成)，松質骨較皮質骨丟失更為嚴重，骨無機鹽和有機質丟失增加，腸道鈣吸收明顯降低等變化，造成骨密度下降，骨組織形態學及超微結構遭到破壞[11]，導致骨生物力學性能的下降。

2.蛋白質組學技術

蛋白質組(proteome)是指由一個基因組、一種細胞或組織在某一特定時刻所表達的包括所有亞型和修飾的全套蛋白質。蛋白質組學(proteomics)就是以蛋白質組為研究對象，從整體角度分析研究細胞內動態變化的蛋白質組成、表達水平、修飾狀態以及蛋白質之間的相互作用與聯系，探索生命現象的本質和活動規律的科學[13-17]。蛋白質組學是21世紀生命科學的重要戰略前沿，其三大支撐技術包括蛋白質的分離、鑒定分析及生物信息學，在研究過程中通過鑒定蛋白質組結構、功能及各蛋白質之間的相互作用關系，最終實現對蛋白質組表達模式和功能模式的研究。

蛋白質組學中分離技術是至關重要的一步，最早的蛋白質組學分離方法是蛋白質的雙向電泳技術。其原理是根據蛋白在第一相中等電點的不同(使用固相pH梯度條即IPG)，在第二相中分子量的大小進行分離(使用傳統的SDS－PAGE膠)，用不同的技術進行染色來顯示這些蛋白質點[12]。質譜技術是指在蛋白質組學中，先用多相分離技術處理樣品后，然后單個蛋白質點或破片通常被胰酶消化最終成為肽片段，然后依據它們的肽段質量指紋圖譜用質譜分析去鑒定是何種蛋白。肽質量指紋圖譜鑒定的數據庫已經建立。把實驗中經酶消化的肽段的肽質量指紋圖譜輸入數據庫就能確定蛋白質氨基酸的序列[13-14]。與其他技術相比有幾個明顯的優點，如高分辨能力和直接檢測蛋白質的翻譯后調節; 但缺點在于，它的高通量分析能力較弱，而且對分離過酸過堿，分子量太大太小的蛋白比較困難。兩個樣品不同蛋白質的準確數據，對定量蛋白質組學提出了新的要求[15]。DIGE技術通過對蛋白質樣品進行雙向電泳前先用熒光進行標記然后將它們混合[16]。這種技術減少了膠內誤差和假陽性率[17]，可以獲得有重大生物學意義的可靠數據。液相色譜質譜法，不同的樣品分析前先用不同的標簽進行標記，如同位素標記親和標簽(ICAT)同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)[18]。其他體內代謝標記過程同樣得到發展，如培養細胞時一個用重氨基酸鏈15N[19,20]進行標記培養，對照組用沒有標記的輕鏈進行培養。蛋白質組學中的絕對蛋白質定量技術正嘗試測量絕對蛋白質水平，通過引入特定蛋白質標志性肽段，提供一個詳細的外部對照標準來對需要測量的蛋白指標進行測量[21]。

3.基于蛋質組學進行的OP相關研究

最新的蛋白質組學對骨質疏松的研究重點集中在破骨細胞和成骨細胞的分化及其功能。應用蛋白質組學技術研究骨質疏松癥取得了許多可喜的進展。例如發現了與成骨細胞分化有關的新蛋白質。楊軍[22]通過比較不同組間股骨蛋白質分子以及圖譜，找到了相對應的差異蛋白質，根據它們質和量的不同，分別命名為Creatine kinase M-type、Serotransferrin、Fructose-bisphosphate aldolase A。Salasznyk[23]用蛋白質組學比較了人成骨細胞和人骨髓基質細胞之間的蛋白表達差異[23]，這個研究集中于鑒定潛在的成骨標記，結果顯示有737個不同的蛋白點。其中有257個(34%)點的在兩種細胞中都表達，剩下的480個點中有312(65%)證明僅在成骨細胞中表達。這個發現表明在成熟的成骨細胞和那些未分化的骨髓基質細胞的蛋白質組有著顯著差異。

Lee[24]應用蛋白質組學技術研究雌激素缺乏在大鼠骨蛋白質表達中的作用，經雙向凝膠電泳、質譜和大鼠蛋白數據庫成功鑒定出3種明顯變化的蛋白質，即硫氧還蛋白過氧化酶-1、阻凝蛋白輕鏈膚-2和泛素化酶E2-17kD，王海彬[25]等在此研究基礎上，發現其中泛素化酶E2-17kD為雌激素相關蛋白，其余兩種則首次報道為骨質疏松相關蛋白；同時在實驗中設立中藥治療組，初步認為這3種蛋白質在絕經后骨質疏松癥發病及中藥治療過程中發揮著重要的調控作用。這些結果為闡明雌激素丟失相關骨質疏松癥的分子機制，提供了實驗依據?？傊?，用定量蛋白質組學研究骨質疏松還是一個新興領域，但是它將骨質疏松的診斷和治療帶入一個全新的時代。

4.頜骨組織中OP相關蛋白

4.1 OP與頜骨的關系

多數學者的研究認為，OP的部位差異性很大，頜骨與骨質疏松間存在著一定的關系[25,26]。頜骨包繞牙齒部分的牙槽骨，作為全身骨代謝最活躍的部位，與全身骨質疏松狀態具有高度的相關性，是最容易出現骨質疏松的部位之一[27]。Binte Anwar等[28]研究去卵巢的猴，將其牙槽骨的微結構與腰椎骨礦物密度比較，發現去卵巢組的頜骨礦物密度較對照組明顯減低，第二磨牙的根間間隔區的骨小梁數、皮質骨厚度均減少，間隔區骨也更多孔，由此得出結論：在這些猴中，雌激素的缺乏導致了磨牙區牙槽骨小梁結構更脆弱。Jonasson等[29]研究表明，第一雙尖牙區牙槽骨厚度與前臂遠中端骨密度密切相關，同時還發現尖牙與側切牙間牙槽突厚度亦與前臂遠中端骨密度密切相關，因而認為下頜骨骨密度可用于推測全身骨質疏松狀態。Hirai等[30]的研究表明，OP的嚴重程度與剩余牙槽嵴高度呈負相關；同時剩余牙槽嵴的高度有明顯的性別差異，女性顯著低于男性，這與婦女絕經后OP有關。王鐵梅等[31]通過計算機處理軟件對口腔牙周健康的40例老年性OP患者和80例健康對照組研究表明，頜骨骨密度與全身骨密度有一定的相關性。因此，大多數學者認為，全身性骨質疏松與頜骨的骨礦丟失之間呈正相關，骨質疏松與下頜骨的萎縮及牙槽骨吸收有顯著的相關性，絕經后女性體內雌激素水平降低，可導致牙槽骨骨質丟失。

4.2 頜骨OP相關基因

尋找OP相關組織蛋白的研究在過去20年已廣泛進行，這些研究基本上著重于以下幾個方面①尋找正常和病變組織中蛋白表達的差異，②研究不同的內源性的調節因子(如激素、受體)的效果。③在藥物治療骨質疏松的過程中蛋白表達的變化等等。

OP是由于骨形成障礙以及成骨細胞和破骨細胞活性的不平衡而引起的，最近的蛋白質組學研究主要集中在這些細胞的分化和它們的功能研究上。來源于具有向多向分化潛能的骨髓基質細胞(BMSC)的成骨細胞，可以合成骨基質，而來源于單核細胞的破骨細胞可以吸收骨[32]。吳璇等[33]研究證實糖尿病骨質疏松癥大鼠頜骨成骨細胞的堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)以及成骨相關基因Runx2表達異常。

雖然蛋白質組學技術在OP的應用越來越廣泛，研究技術不斷進步并取得了一些成績，但是該技術對OP頜骨組織蛋白這一領域的應用目前還處于起步的階段，目前已經發現并鑒定了高表達的頜骨骨質疏松癥相關蛋白為數不多，其中一些如COMP、Coll2、MMPs先前的對骨關節炎疾病中就已經被發現，最近再次被蛋白質組學證實是頜骨OP的生物標志物[34]。Kawase等[35]從健康志愿者的牙槽骨獲取骨膜組織，檢測誘導成骨過程中蛋白質的表達，發現在成骨分化過程中，除了IL-6、ANG、LIF等已道的因子上調外，HSP-27的表達也明顯增加。但是，誘導成骨分化的機制目前仍不清楚，吳璇[36]發現葡萄糖轉運蛋白-1及胰島素受體α1的在糖尿病骨質疏松大鼠下頜骨成骨細胞中高表達。

隨著21世紀生物技術的進步和納米技術的興起，蛋白質組學技術將日臻完善，自動化、高通量和高靈敏度等優點將使其在骨質疏松癥頜骨蛋白篩選，發生機制，骨質疏松癥后組織修復再生工程以及生物靶向治療和藥物研發等研究領域中具有廣闊的應用前景。

5.小結

以上研究結果表明全身骨質疏松與頜骨骨質丟失具有密切的相關性,人口老齡化的增高，人類對于OP和頜骨骨量喪失的相關研究將會進一步深化，近年來新發展起來的蛋白質組學改變了傳統基因和蛋白質檢測技術的局限性，具有全面性、高通量及大規模等優點，可以從整體、動態和探索的角度對一個組織或細胞的基因組及其表達的全部蛋白質進行研究，深入地探索骨質疏松對頜骨骨丟失病理生理活動規律。蛋白質組學及相關實驗技術的飛速發展，為骨質疏松頜骨病變的研究提供了全新的視野和更為廣闊的技術平臺。

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