牙本質基質蛋白-1及其相關蛋白礦化作用的研究進展*

占 柳 謝淑娟 潘衛紅

牙本質基質蛋白-1(DMP-1)是在大鼠cDNA文庫中檢測到的酸性磷酸化細胞外基質蛋白，是礦化組織中非膠原蛋白的重要組成部分。DMP-1主要表達于牙齒，但近年來的研究發現其在骨組織、腎臟、胰腺等其它部位亦見表達，牙本質基質蛋白1不僅參與未分化間充質細胞向成牙本質細胞分化，還介導了牙本質的礦化和細胞間的信號轉導[1]，但具體的機制尚未明確。

1. 牙本質基質蛋白-1的基因結構

DMP-1基因是首個被克隆的牙本質相關基因。到目前為止，人類已經成功克隆了大鼠、小鼠等多種動物及人的DMP-1基因全序列。DNA序列分析顯示牙本質基質蛋白-1富含天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸，且其具有許多潛在的酪蛋白激酶Ⅰ和酪蛋白激酶Ⅱ的磷酸化位點，同時具有一個潛在的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)細胞附著序列和一個經證實的N-糖基化一致序列。

大鼠DMP-1由489個氨基酸殘基組成，其cDNA基因包含6個外顯子和5個內含子，全長為13kb。第一個外顯子長約95bp，編碼5’端非翻譯區的大部分區域；第二外顯子長約19bp，編碼5’端非翻譯區，氨基酸殘基的信號肽以及N末端的兩個氨基酸；第3、4、5外顯子分別編碼16、11、15個氨基酸。其中第5外顯子是由多個片段接合而成；第6外顯子是牙本質基質蛋白-1的基因中最大的外顯子，包含了80%的編碼信息，約占cDNA全長的1/10，編碼3’端非翻譯區、終止碼和與細胞黏附相關的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸細胞附著序列(RGD)三肽序列。外顯子與內含子邊界的確定，屬于0類型，即外顯子與內含子在邊界合作中密切貼合，遵從經典的GT/AG規則。5個內含子的長度分別為3791bp、465bp、2047bp、162bp、1375bp，其編碼的5個內含子中第一個內含子最大，對DMP-1在組織中的特異性表達起到重要的作用[2]；第4內含子最小。Pang Jl等[3]的研究初步確定了DMP-1上游啟動子序列在成牙本質細胞分化中的調控作用及機制。在同源性方面，大鼠與人的基因序列的同一性為66.2%。另外，DMP-1基因還包含了SP1、AP1、GATA、CREB、C-Myc等基因的接合位點以及ELK1、ISRE等的血清反應元件[4-6]。

除DMP-1外，DMPS的家族成員還有DMP-2和DMP-3。DMP-2屬于牙本質磷蛋白家族，富含絲氨酸和天門冬氨酸，是細胞外基質(ECM，extracellular matrix)生物礦化的初始調控蛋白。與DMP-2相比，DMP-3基因具有DSP基因編碼序列，編碼小型牙本質磷蛋白(minni-PP)。且DMP-2的兩個功能域之間無終止碼。

2. 核心結合因子及轉錄調控因子對牙本質基質蛋白-1的表達的影響

①核心結合因子-1(Cbfɑ1)對牙本質基質蛋白-1表達的影響

近年來的研究表明，Cbfɑ1的功能對骨形成領域的掌握和研究有重要的影響。Cbfɑ1表達于成骨細胞譜系的細胞中，并調節骨形成特異性基因的表達，同時它是成骨細胞和成牙本質細胞分化的關鍵。核心結合因子Cbfɑ1是成骨細胞分化的特異性轉錄因子，Cbfɑ1基因敲除實驗表明Cbfɑ1在骨和牙的發育過程中起到至關重要的作用。在Cbfɑ1缺乏的動物中，同時發現骨發育不全或牙發育不全的癥狀。JQ.Feng[7]等通過體外凝膠電泳實驗，Cbfɑ1瞬時轉染結合無Cbfɑ1因子小鼠的體內研究，證實DMP-1是骨發育初始階段軟骨細胞和成骨細胞的標記基因，同時在軟骨和骨發育的過程中，DMP-1是Cbfɑ1一個重要的目標分子，Pang Jl[3]等通過熒光素酶活力測試顯示，在成牙本質細胞分化的過程中，Cbfɑ1正調節DMP-1的表達并對DMP-1瞬時表達形式產生影響。

在骨骼的發育過程中，Cbfɑ1與DMP-1的表達有時候會有所重疊，但 Cbfɑ1的表達早于DMP-1。JQ.Feng[7]等在研究 Cbfɑ1 和 DMP-1 的表達模式時發現，在小鼠胚胎發育的第12.5天，軟骨形成；在胚胎發育的第14.5天，骨化開始；在胚胎發育的第16.5天，骨快速形成。在E12.5天并未發現DMP-1的表達，而Cbfɑ1在軟骨組織中明顯表達。在E14.5天，Cbfɑ1在軟骨組織中繼續高度表達，在此階段，發育的骨中能夠觀察到DMP-1的表達，但僅限于含有肥大軟骨細胞的區域。在E16.5天，DMP-1表達于肥厚的軟骨細胞和成骨細胞中，與Cbfɑ1的表達相重疊。JQ.Feng通過對突變體小鼠的研究也證實了無Cbfɑ1突變體小鼠缺乏成熟的骨組織且牙齒發育不全。這說明Cbfɑ1是骨組織和牙齒發育過程中的一個重要的調節因子。Cbfɑ1轉染表達媒介能夠誘導C3H10T1/2細胞內DMP-1的表達，且與其劑量成正相關關系。說明Cbfɑ1功能性地調節了DMP-1的表達。

然而，在出生后小鼠骨的發育過程中，Cbfɑ1的表達與DMP-1的表達逐漸相脫離。在產后2周齡的動物體內，DMP-1在肥大的軟骨細胞和骨細胞中高度表達，在產后8周齡的動物體內，DMP-1在骨細胞中高度表達，Cbfɑ1在軟骨細胞和骨細胞中均未表達，卻高度表達于成骨細胞中[7]，由此表明，Cbfɑ1與DMP-1在出生后小鼠骨的發育過程中，這種相關性已消失。

②轉錄調控因子c-Jun、c-Fos對牙本質基質蛋白-1的轉錄調控作用

DMP-1是在成牙本質細胞分化過程中能表達具有時空特異性的細胞外基質的酸性磷酸蛋白，雖然在動物試驗中已經分離出DMP-1啟動子，然而，轉錄調控因子是如何調控DMP-1啟動子，我們知之甚少。

轉錄因子AP1(activator protein 1)家族可參與細胞增殖和分化，是骨組織和牙組織的特異性轉錄因子，這些轉錄因子的同位反應元素存在于DMP-1的啟動因子中，結合MatInspector 軟件分析結果，可推測c-Jun和c-Fos是通過結合人DMP-1啟動子區的作用位點從而發揮對DMP-1的調控作用[8,9]。逄鍵梁[10]等的研究表明c-Jun和c-Fos可降低人DMPl基因轉錄活性，是HDPSCs向成牙本質細胞方向分化重要的調節因子，DMP-1啟動子序列-110～-100bp區可能是c-Jun、c-Fos有效作用位點。

c-Jun和c-Fos是AP1超蛋白家族的主要成員，Narayanan K[11]等推測c-Jun和c-Fos可能參與牙本質細胞時空表達Dmp-1的調控過程。C-Jun的mRNA水平隨著牙本質細胞的分化程度而增加，其在年輕和成熟的成牙本質細胞中均有表達，說明c-Jun參與牙胚中成牙本質細胞分化的轉錄調控過程，可作為成牙本質細胞的標志物。Hirata M[9]的研究發現，大鼠磨牙牙冠處臨近牙本質礦化的成牙本質細胞中，有c-Fos的表達，其表達可能與成牙本質細胞中增強的骨鈣素水平相關。總而言之，c-Jun和c-Fos在早期成牙本質細胞分化過程中發揮作用，而在中末期分化的成牙本質細胞中的作用并不明顯。

3. 牙本質基質蛋白-1的功能

①DMP-1在牙本質礦化中的作用

目前，學者們并不確定牙本質基質蛋白-1的確切功能，Gajjeraman[12]等研究表明，大鼠重組DMP-1全基因及天然DMP-1C末端在Ⅰ型膠原的作用下均可加速羥磷灰石的成核作用，而DMP-1N末端則抑制其成核作用。由于DMP-1的組成中富含大量的絲氨酸，而絲氨酸多以磷酸化的形式存在，使得DMP-1成為等電點為3.68的強酸性蛋白，且磷酸化的氨基末端，可以與Ca2+結合。由此推測，DMP-1能夠使羥磷灰石成核。在此過程中，DMP-1首先與Ca2+結合并啟動礦物質沉積，隨著成核的無定形鈣磷沉淀物成熟，進而擴大融合，最終導致晶體形成[13,14]。另外，DMP-1基因的N末端氨基酸序列可以啟動和穩定非平衡狀態下的晶體以及核周圍的微環境[15]。

DMP-1由成牙本質細胞合成分泌并在極化的牙本質細胞頂端表達，然后沿著細胞突分泌到礦化組織的前沿，像DMP-1這樣的酸性蛋白質是成牙本質細胞礦化過程中重要的有機基質成分和參與核。成牙本質細胞的礦化是一個多步驟的復雜過程，精確地細胞介導機制參與調控這一過程。首先，組織形成細胞分泌結構性基質蛋白，這些結構性基質蛋白決定了組織的形狀，并提供有序的、定向晶核形成和生長的空間。其次，組織形成細胞分泌一系列磷酸化的DMP-1，當晶核的形成和生長機制被啟動，在不同的成核程序中，具有調控功能的酸性大分子DMP-1在特定的位點進入結構性基質中。正因為DMP-1結合鈣離子和結構性基質的相互作用，最終調節晶體的生長、形態及礦化核的最終大小。

DMP-1除了具有Ca2+結合的能力，還具有高度的親和力，可以和Ⅰ型膠原纖維結合，增加重建的Ⅰ型膠原纖維的直徑[16]。另外，膠原蛋白中還含有少量的Ⅴ型膠原，經大量的研究證實，Ⅴ型膠原大分子形成原核后，Ⅰ型膠原交聯到Ⅴ型膠原中，膠原纖維交織成網，從而為牙本質的礦化提供支架和空間。AtulSuresh Deshpande[17]等通過投射型電子顯微鏡觀察發現磷酸化的DMP-1與非磷酸化的DMP-1的主要區別在于磷酸化的DMP-1誘導礦化部分成核，在此過程中無需膠原纖維的參與。

②DMP-1在骨組織形成和改建中的作用

DMP-1高度表達于胚胎發育過程中的成骨細胞。其表達與骨細胞核的形成與礦化密切相關，DMP-1存在于礦化早期的成骨細胞核內，在成骨細胞礦化的過程中，Jun-B和p300協同作用，能夠顯著地調控DMP-1的啟動子的活性。p300內源性組蛋白乙酰轉移酶活性在DMP-1表達調控中有著重要的作用[18]。Jun-B的Ser-79位置的磷酸化及Jun-B與p300之間的相互作用對成骨細胞的礦化同樣十分重要。定性研究表明，機械負載對骨細胞中DMP-1的表達起到重要的調控作用，為了應對機械負載，骨細胞中的DMP-1被誘導表達，DMP-1 的氨基酸序列含有酸性結構域，攜帶負電荷，與攜帶正電荷的鈣離子有很強的結合能力，因此能促進羥基磷灰石的形成并調控骨細胞的分化，在體內參與硬組織的礦化過程。在骨折愈合過程中，DMP-1通過對破骨細胞的黏附，從而激活破骨細胞，進而增強骨痂改建。

近年來，學者們對DMP-1的研究不斷深入，DMP-1的基因結構、特異性表達極其礦化功能已經逐漸被認識。但是，DMP-1對成牙本質細胞分化和成熟的具體機制、如何調節牙本質和骨組織的形成等尚不明確，及其在修復性牙本質中的具體調控機制、對牙齒和骨組織礦化過程的調控作用尚不清楚。因此，對于DMP-1的探討，在今后的研究中還有很多問題有待解決。

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