冬蟲夏草發酵技術的研究進展*

勞景輝，閆文娟，方佳茂，陳偉濱

(1.廣東省微生物研究所，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東省華南應用微生物重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，廣東 廣州 510070；2.廣東迪美生物技術有限公司，廣東 廣州 510070；3.廣東環西生物科技股份有限公司，廣東 揭陽 515343)

冬蟲夏草Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora，是線蟲草科（Ophiocordycipitaceae）、線蟲草屬（Ophiocordyceps）的蟲生真菌[1]，寄生于蟲草蝙蝠蛾幼蟲體上，由蟲形菌核（僵蟲）和子座（草部）組成。由于冬蟲夏草具有多種的藥理活性，如抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化和提高免疫力等[2]，一直被視為珍貴的中藥材而得到廣泛的應用。但鑒于天然冬蟲夏草對生長環境要求高，生長率低，加之人們對其需求的日益增加，使得野生的冬蟲夏草資源緊缺，其價格甚至比黃金還高。因此，以發酵等方法探索對冬蟲夏草進一步開發利用的新途徑成為了研究的熱點。本文從冬蟲夏草發酵無性型菌株的鑒定及篩選、液體發酵工藝的優化、固體發酵技術的開發和發酵產物的評價及應用等方面對冬蟲夏草發酵進行了綜述。

1 冬蟲夏草發酵菌株的研究概況

發酵研究的關鍵之一是要采用真正的冬蟲夏草菌株。由于部分早期研究沒有考慮到冬蟲夏草不適應高溫、生長緩慢等特點，加上其它技術上的原因，致使部分用于發酵研究的“冬蟲夏草”菌株其實只是長于冬蟲夏草上的其它菌。但隨著對冬蟲夏草的認識不斷加深及相關研究技術的發展，真正的冬蟲夏草開始被廣泛研究。1977年，沈南英開始對冬蟲夏草生態進行研究，2年后成功分離到冬蟲夏草菌種（該菌種的無性型后被證明為中國被毛孢）[2]，并于1983年首次發表了有關該真菌菌種分離研究的論文[3]。1989年劉錫進

王等分離到與沈南英相同的冬蟲夏草菌種無性型，定名為中國被毛孢（Hirsutella sinensis X.J.Liu,Y.L.Guo,Y.X.Yu&W.Zeng） 并正式發表[4]。1999年趙錦等從分子生物學角度證明冬蟲夏草無性階段是中國被毛孢[5]，并于2000年把該鑒定方法申請中國專利，即鑒別冬蟲夏草的特征性核苷酸序列和方法（CN00114160.0）。2004年蔣毅等認為中國被毛孢與天然冬蟲夏草菌種一致[6]。2005年中國菌物學會再次確認冬蟲夏草菌的無性型是中國被毛孢。至于冬蟲夏草的有性型名稱，過去曾長時間采用Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.的拉丁學名，到2007年則變為Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora[1，7]，中文可譯為中國線蟲草 （即冬蟲夏草）。本文采用了這一新的拉丁學名。

近年來報道從冬蟲夏草上分離出來的無性型有很多，但只有中國被毛孢（Hirsutella sinensis）經接種蝙蝠蛾幼蟲，并完成了從染菌直到長出子實體的全過程，證明是冬蟲夏草的無性型菌株[8]，而冬蟲夏草頭孢（Cephalosporium dongchongxiacae N.Y.Shen,S.M.Zhang,L.Zeng,X.C.Zhang&S.L.Wei）、蟲草頭孢（Cephalosporium sinensis C.T.Chen）、蝙蝠蛾被毛孢（Hirsutella hepiali C.T.Chen&N.Y.Shen） 和中華束絲孢（Synnematium sinense X.C.Yin&N.Y.Shen） 等也已被證明是中國被毛孢（H.sinensis）的同物異名[9，10]，而其它更多的發酵菌株則尚未確定是中國被毛孢（H.sinensis），因此相關的研究還需繼續進行，而本文所綜述的發酵研究，均基于可靠的菌種來源或其菌株符合冬蟲夏草的生長規律。

2 冬蟲夏草液體發酵的研究概況

菌絲體干重是冬蟲夏草液體發酵條件及培養基篩選的主要指標之一。張忠廣等發現在pH 5.5、裝量40%、溫度18℃～20℃、轉速 100 r·min-1～120 r·min-1、培養時間 96 h的適宜條件下，以S31培養基和a培養基，對冬蟲夏草菌進行液體發酵，得到的菌絲干重達0.028 g·mL-1左右[11]。多糖作為冬蟲夏草的重要有效成分之一，其產量也常被作為實驗的評價指標。全衛豐等以產胞外多糖為參考指標，對冬蟲夏草液體發酵培養基及發酵條件進行研究，發現培養基配比為蔗糖3%、玉米粉5%、豆餅粉4%、七水硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.1%、維生素B1為0.01%，于22℃、pH 6.5、轉速120 r·min-1，搖瓶培養7 d，所得胞外粗多糖產量為5.86 g·L-1[12]；張國英對冬蟲夏草無性型菌株中國被毛孢進行了原生質體的紫外誘變育種，以菌絲體濕重和多糖含量為指標，篩選出誘變菌株M1069#，通過鑒定后對其進行培養基單因素實驗和優化實驗，得出最優化發酵培養基，實驗后得到的菌絲體含量達6.31 g·瓶-1，多糖含量為12.1%[13]。

近年來，Dong等對冬蟲夏草深層發酵進行單因素和正交實驗，發現培養基中含有蔗糖、蛋白胨、維生素B、鈣、鋅和碳氮比為12∶1時是最有利于菌絲體生長的，而蔗糖、蛋白胨和酵母提取物的最佳濃度分別是50 g·L-1、10 g·L-1和3 g·L-1，經過40 d的發酵，所得的菌絲體生物量超過22 g·L-1[14]；隨后，Dong等又進一步發現6株冬蟲夏草菌株的最適生長溫度范圍是15℃～18℃，超過21℃時則生長緩慢，達25℃及以上溫度時便會停止生長；而冬蟲夏草的生長周期即使在最佳條件下，依然相對較長，其液體發酵也經歷延滯期、對數生長期、穩定期和死亡期，當中的對數生長期更是長達10 d，如果以菌絲體作為目標產物，則整個發酵周期需25 d～30 d[15]。

3 冬蟲夏草固體發酵的研究概況

3.1 固體發酵概述

相對于液體發酵技術，固體發酵的設備較為簡單，而且廢液排放少，有利于減輕環境污染及生產成本控制，并且其后處理相對簡單，只需將發酵物干燥粉碎即可，可避免液體發酵技術工藝復雜、容易污染和設備投資大等缺點。另外，固體發酵對于某些研究材料來說，可以比液體發酵的產量有所提高，而且該發酵方式特別適合于絲狀真菌[16]，因此，真菌的固體發酵技術已逐漸得到人們的重視，但有關冬蟲夏草固體發酵的研究卻少有報道。

3.2 冬蟲夏草固體發酵及其應用研究

葛飛等以麥角甾醇含量為指標，對冬蟲夏草無性型，即中國被毛孢的固體發酵進行研究，發現固體發酵最佳培養基為大米5 g、玉米粉2 g、蠶蛹粉1 g、麥麩2 g，適宜的培養條件為培養溫度20℃、料水比1∶1.5、料層厚度2 cm，且無光照時對菌絲生長較為有利，所得菌絲體的麥角甾醇含量較未優化的提高了38.6%[17]。Zhang等發現陳米經過冬蟲夏草菌的發酵后，其營養物質如蛋白質、碳水化合物、脂質、膳食纖維、維生素E、氨基酸和麥角甾醇等都高于發酵前的陳米，而且提高了其超氧化物歧化酶的活性，為陳米的有效利用提供了一種新方法[18]；王祥誠等利用冬蟲夏草菌來發酵蕨渣，生產菌質多糖，發現最佳工藝條件為蕨渣比例85%、基質含水量60%、培養溫度22℃，而且基質含水量偏低有利于菌絲生長，如果偏高則菌質多糖得率偏高[19]。閆文娟等對冬蟲夏草固體發酵物的抗疲勞作用進行了研究，發現灌胃喂養冬蟲夏草固體發酵物水提液的小鼠，負重游泳時間顯著延長[20]。

4 冬蟲夏草發酵產物的質量評價

王尊生等對冬蟲夏草菌絲體固體發酵粉進行成分分析，發現發酵粉中3'-脫氧腺苷、甘露醇的含量明顯高于冬蟲夏草子實體中相應成分的含量；各種氨基酸的含量和水平，與冬蟲夏草子實體中相應的氨基酸的含量和水平相當；發酵粉中的其他化學成分和冬蟲夏草子實體中相應成分基本一致[21]。丁婷等發現冬蟲夏草無性型菌株發酵液中核苷類成分分別為腺苷、尿苷、鳥苷，其含量均高于對照品冬蟲夏草生藥[22]。王英超等對冬蟲夏草菌液體發酵過程中的酶活性進行測定，發現淀粉酶、糖化酶、中性及酸性蛋白酶的活力均隨反應時間的延長而逐漸增加[23]。Li等研究表明，現在對冬蟲夏草及制品的檢測指標主要有核苷、麥角甾醇、甘露醇和多糖等化合物，而另一種方法則是通過比對相應組分的化學圖譜來對冬蟲夏草進行質控，如CE（毛細管電泳）等，相對于對單個化合物的鑒定，這種方法更為方便可行[24]。

5 小結與討論

綜上所述，目前對冬蟲夏草發酵的研究主要包括菌株的篩選、液體發酵工藝的摸索、固體發酵技術的開發和發酵產物的評價及應用幾個方面，其中確定研究菌株是否是真正的冬蟲夏草無性型（中國被毛孢）成為其中最關鍵的問題之一。近年來，有許多關于冬蟲夏草發酵研究的報道，但當中有很多的研究結果不太一致，如培養溫度的選擇，范圍從18℃～30℃都有報道，如吳彩琴等的研究[25]；培養時間的長短，范圍從48 h～40 d也有報道，但冬蟲夏草是一種生長緩慢，且生長溫度相對較低的真菌，所以溫度和生長周期應該是其重要的研究考慮因素[15，26]，而很多研究都忽略了這一點，也缺乏對研究菌株的鑒定，因此，相關研究的菌株可靠性還需要進一步證實。出現上述情況可能有以下幾個原因：第一，可能研究菌株并非真正的冬蟲夏草；第二，可能該冬蟲夏草菌株經過改良，已經可以適應相對較高的溫度；第三，該實驗可能只在該次實驗條件下成立。對此，僅對有可靠菌種來源或從培養溫度和時間上符合冬蟲夏草生長規律的發酵研究進行綜述。

鑒于冬蟲夏草對生長環境和培養條件的苛刻要求，分離出真正的菌種是非常關鍵的，而目前人們對冬蟲夏草的研究主要是集中于其藥理活性的開發，各種與冬蟲夏草相關的制品在保健品市場隨處可見，如百令膠囊、金水寶膠囊、寧心寶膠囊、至靈膠囊和心肝寶膠囊等。但研究發現，當中某些產品的確是用冬蟲夏草的無性型來生產的，但也有一些是來源于天然冬蟲夏草菌菌體上分離到的其它菌類，并非真正的冬蟲夏草菌[27]。當然并不否認，從冬蟲夏草菌體上分離到的某些非冬蟲夏草無性型的其它真菌也會有很好的保健或藥用功效，如蝙蝠蛾擬青霉。但從科學的角度來看，這些研究與真正的冬蟲夏草菌種關系不甚密切。所以，進行對冬蟲夏草的研究之前，對研究菌株進行鑒定是很有必要的。分子生物學方法是鑒定冬蟲夏草無性型的有效方法之一[9]，只要能以科學的態度去對待研究及生產上所采用的“冬蟲夏草”菌種問題，通過分子生物學等技術手段，則可對冬蟲夏草的發酵研究有更深入的認識。

[1]Sung GH,Jones NLH,Sung JM,et al.Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi[J].Studies in Mycology,2007(57):57-59.

[2]柯傳奎.話說冬蟲夏草[M].浙江：浙江科學技術出版社，2007.

[3]沈南英，曾璐，張顯恥，等.冬蟲夏草真菌的分離[J].食用菌，1983，3(5)：1-5.

[4]劉錫進王，郭英蘭，俞永信，等.冬蟲夏草菌無性階段的分離和鑒定[J].真菌學報，1989，8(1)：35-40.

[5]趙錦，王寧，陳月琴，等.冬蟲夏草無性型的分子鑒別[J].中山大學學報：自然科學版，1999，44(1)：123-125.

[6]蔣毅，姚一建.蟲草屬分子系統學研究現狀[J].菌物研究，2004，2(1)：58-67.

[7]Kirk PM,Cannon PF,Minter DW,et al.Dictionary of the fungi 10th edition[M].CABI Europe-UK,2008.

[8]陳仕江，姚逸，尹定華，等.冬蟲夏草菌無性型深層發酵的研究概況[J].重慶中草藥研究，2001，44(2)：37-39.

[9]蔣毅，姚一建.冬蟲夏草無性型研究概況[J].菌物系統，2003，22(1)：161-176.

[10]魏鑫麗，印象初，郭英蘭，等.冬蟲夏草及其相關類群的分子系統學分析[J].菌物學報，2006，25(2)：192-202.

[11]張忠廣，喬正強，柳慧玲，等.冬蟲夏草菌液體發酵培養試驗初報[J].食用菌，2006，28(增)：25-31.

[12]全衛豐，汪潔，杜姝蓮，等.冬蟲夏草液體發酵產胞外多糖的研究[J].發酵科技通訊，2007，36(3)：2-4.

[13]張國英.冬蟲夏草誘變育種與液體發酵生產多糖和菌絲體的研究[D].吉林大學，2011.

[14]Dong CH,Yao YJ.Nutritional requirements of mycelial growth of Cordyceps sinensis in submerged culture[J].Journal of Applied Microbiology,2005(99):483-492.

[15]Dong CH,Yao YJ.On the reliability of fungal materials used in studies on Ophiocordyceps sinensis[J].Journal of Industrial Microbiol Biotechnol,2011(38):1027-1035.

[16]Martins S,Mussatto SI,Martinez-Avila G,et al.Bioactive phenolic compounds:production and extraction by solid-state fermentation.a review[J].Biotechnology Advances,2011(29):365-373.

[17]葛飛，桂琳,李春如，等.冬蟲夏草無性型-中國被毛孢固體發酵條件的初步研究[J].生物學雜志，2009，26(3)：22-25.

[18]Zhang Z,Lei Z,Lǚ Y,et al.Chemical composition and bioactivity changes in stale rice after fermentation with Cordyceps sinensis[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2008,106(2):188-193.

[19王祥誠，余有貴，程里，等.冬蟲夏草固體發酵蕨渣生產菌質多糖[J].食品研究與開發，2010，31(7)：148-151.

[20]閆文娟，李泰輝，勞景輝，等.冬蟲夏草固體發酵物水提液抗疲勞作用初步研究[J].食用菌學報，2012.

[21]王尊生，顧宇翔，周麗，等.冬蟲夏草 (Cordyceps sinensis)菌絲體固體發酵粉化學成分的分析[J].天然產物研究與開發，2005，17(3)：331-336.

[22]丁婷，胡豐林，耿德貴，等.冬蟲夏草及其無性型菌株發酵液中核苷類成分的HPLC法定量分析[J].食品與發酵工業，2006，32(6)：97-99.

[23]王英超，李天俊，任健.冬蟲夏草菌液體發酵過程中酶活性的測定與分析[J].食用菌，2006，28(2)：19-21.

[24]Li SP,Yang FQ,Tsim Karl WK.Quality control of Cordyceps sinensis,a valued traditional Chinese medicine[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2006(41):1571-1584.

[25]吳彩琴，陳野，郝迎.固體發酵生產冬蟲夏草多糖的研究[J].食品科學，2009，30(7)：186-189.

[26]Barseghyan GS,Holliday JC,Price TC,et al.Growth and culturalmorphological characteristics of vegetative mycelia of medicinal caterpillar fungus Ophiocordyceps sinensis G.H.Sung et al.(Ascomycetes)isolates from Tibetan plateau (P.R.China)[J].International Journal of Medicinal Mushrooms,2011,13(6):565-581.

[27]鄒秦文，肖新月，林瑞超.冬蟲夏草液體深層發酵菌絲體相關制劑的研究現狀[J].藥物分析雜志，2009，29(4)：680-687.