孤獨癥動物模型的研究進展

王 偉，姜慧軼，杜 琳，王 冰，馮俊燕，李 寧，段曉燕，賈飛勇

（吉林大學第一醫院 二部兒科神經康復組，吉林 長春130031）

孤獨癥，又稱自閉癥，這一概念最早是由瑞士精神病醫生Eagen Bleuer提出的，而第一例關于孤獨癥的臨床研究是由美國臨床醫學家Kanner在1943年首先報道［1］。兒童孤獨癥是一種較常見的嚴重的神經系統發育障礙性疾病，主要表現為兒童自幼開始在語言交流和非語言交流方面存在嚴重障礙、重復刻板行為等。近期研究顯示，孤獨癥無論在內涵還是外延上都已遠遠超出了傳統的孤獨癥模型，而且還有一些類似孤獨癥表現的疾病：如脆性X染色體綜合征（Fragile X syndrome，FXS）；結節性硬化（Tuberous sclerosis，TSC）；阿斯伯格綜合征（Asperger syndrome，AS）；雷 特 綜 合 征 （Rett syndrome，RTT）；非特異性的廣泛發育障礙（PDDNOS）等等，研究體系傾向于將這些統稱為孤獨癥譜系障礙（Autism Spectrum Disorder，ASD）。孤獨癥長期以來一直是人們關注的焦點和難點問題，目前該病不僅僅是一個醫學問題，而是一個急需全世界關注的社會問題。故而一種成功的自閉癥模型是破解神經系統與孤獨癥關系的關鍵，這能夠為我們探討孤獨癥的發病機制和治療方法提供更便捷的手段。現就孤獨癥動物模型的研究現狀作一綜述：

1 環境因素模型

孤獨癥兒童常常表現出氧化應激和甲基化損害，這可能與環境污染、化學物質或毒性物質暴露有關。此外，當母體受到一些神經毒素及抗體的影響也會使后代產生孤獨癥樣的癥狀。

1.1 母體免疫模型 近期一個大型的流行病學調查證實了妊娠期母體感染是孤獨癥的危險因素。這項調查研究10000例孤獨癥患者，發現母體在孕期前3個月的病毒感染與其密切相關［2］。流感病毒引起的母體呼吸系統感染，雙鏈多核苷酸 （polyi－nosine：cytosine，Poly IC）或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）導致母體免疫激活（maternal immune activation，MIA）已經被應用建立嚙齒類動物的孤獨癥模型。Poly IC是一種干擾素誘導物，具有雙鏈RNA結構，能夠刺激吞噬細胞，促進抗體形成。Poly IC母體免疫激活模型的后代的行為方面、神經病理學、神經化學、結構核磁共振和電生理學等均已有廣泛研究［3，4］。Poly IC免疫激活模型的后代表現出的行為與孤獨癥的表現極其相似，如社會交往缺乏，交流障礙，自我理毛、反復筑巢以及在水迷宮試驗中的刻板行為［3］。脂多糖是革蘭陰性細菌細胞壁中的一種成分，其脂酰鏈嵌入在細菌外膜上，糖鏈暴露于細菌的表面，具有抗原性。Kirsten［5］等的研究中，利用Wistar鼠在妊娠9.5天時腹腔注射LPS模仿革蘭氏陰性細菌感染建立孤獨癥模型，在子代中雄性鼠大多表現出學習和記憶能力減退及重復刻板行為，而且在進一步的研究中，他們利用免疫組化及PCR的方法檢測紋狀體多巴胺系統中的酪氨酸羥化酶、多巴胺D1A、D2受體及神經膠質細胞，發現在妊娠期的LPS暴露可降低紋狀體多巴胺的代謝水平，這可能與多巴胺合成的減少而損害了紋狀體多巴胺系統有關。這些研究表明，母體感染后母體免疫激活模型的研究在孤獨癥和精神分裂癥中都具有預測價值。一些干擾措施可以改善子代的母體免疫效果，有實驗［6］顯示，母體給予LPS的子代的一些異常行為能利用抗精神病藥物干預而減輕神經病理學病變。妊娠鼠應用乙酰半胱氨酸早期干預后，降低LPS模型胎兒的炎性反應，阻止脂多糖模型母體的反應［7－9］。白細胞介素（interleukin，IL）是一種激活及調節免疫的細胞因子，介導T細胞、B細胞活化、增殖與分化，在炎癥反應中起重要作用。改變IL的水平能夠進而改變母體免疫激活的效果，Poly IC模型小鼠在孕期注射IL－6能誘導許多異常行為。相反，注射IL－6抗體的孕鼠能減輕polyIC的效應從而產出正常的子代［10］。在 Girard［11］等的試驗中，給予妊娠鼠大劑量的LPS可導致胎盤的炎性損害，而IL－1受體的拮抗物能阻止這種反應。抗炎細胞因子IL－10的應用能預防子宮的細菌感染，它對注射LPS或者Poly IC的小鼠均有保護作用。內源性的IL－10能對抗LPS從而縮短產程和減少胎鼠損害。因此應用這種細胞因子，能增強機體的自然保護。然而，給予沒有母體免疫激活的妊娠期小鼠應用IL－10能導致成熟的子代的行為異常，這個發現很可能與正常人類妊娠期的炎癥反應增強有關［12］。具有抗炎作用的噻唑烷二酮和匹格列酮能顯著地降低孤獨癥兒童的易怒、嗜睡、刻板行為和多動癥，且對年齡較小的患者效果更大［13］。母體免疫模型為一些新的治療方法的研究提供了平臺，而且揭示在無母體免疫激活后代的細胞因子的控制能誘發其行為的改變。

1.2 丙戊酸模型 丙戊酸（valproic acid，VPA）最早于1964年在法國作為抗癲癇藥，之后作為情緒穩定劑，主要應用于癲癇和雙相情感障礙，亦可應用于偏頭痛和精神分裂癥。臨床上VPA用于控制失神發作、強直陣攣、復雜部分性發作癲癇和Lennox－Gastaut綜合征。孕期應用VPA可引起孤獨癥。最早發現VPA引起孤獨癥是Chritianson發現7例胎兒VPA綜合征兒童完全符合孤獨癥的診斷標準［14］。為了進一步證實胎兒早期腦干損傷導致孤獨癥假說，Rodier于1996年建立了大鼠VPA孤獨癥模型［15］。動物發育學研究表明，胎鼠的神經管閉合時間于孕11.5天開始，Rodier等分別于受孕第11、11.5、12、12.5天給予孕鼠350mg／kg單次腹腔注射，結果發現胎鼠12.5天注射VPA可引起三叉神經、舌下神經、展神經、動眼神經等神經核的運動神經元減少［16］。Ingram的進一步研究發現12.5天給予孕鼠單次腹腔注射600mg／kg的VPA可引起小腦蚓部浦肯野神經元減少［17］。這些結果與人類孤獨癥尸檢病理結果完全一致［18］。VPA處理子代鼠顯著增加了額皮層、海馬、小腦和外周血5－羥色胺水平，與人類孤獨癥5－羥色胺系統的改變有著驚人的相似［19］。在此后的VPA孤獨癥模型中的行為學檢查發現孤獨癥大鼠表現為對痛覺不敏感、而對非痛覺刺激敏感；多動、動作重復刻板、探索活動減少；社會行為減少、出現社會行為的潛伏期延長［20－22］。因此，懷孕第12.5天（ED12.5）單次腹腔注射VPA600mg／kg可以誘發可靠的孤獨癥動物模型。

1.3 丙酸模型 丙酸（propionic acid，PPA）一種短鏈脂肪酸，是腸道內細菌的代謝終產物，曾被用作食物防腐劑。Shultz［23］等的實驗發現，小鼠腦室內注射PPA可導致與人類孤獨癥癥狀相似的大腦和行為異常。他們利用水迷宮和腦電活動地形，測試PPA模型小鼠的認知和感覺運動功能，PPA組小鼠神經病理性損害的分析中顯示出先天的神經炎癥反應，證明PPA能改變小鼠的大腦功能和行為支配，產生孤獨癥樣癥狀。另有實驗［24］顯示，腦內注射PPA模型的小鼠腦內的脂類代謝可能與孤獨癥樣癥狀的產生有關。基于某些腸道或飲食因素能夠短時間的加重孤獨癥的癥狀，MacFabe［25］等人研究了應用丙酸及其相關化合物的大鼠的行為、電生理、神經病理及生化，心室內注射丙酸能夠導致可逆的重復刻板行為、易怒、旋轉、局灶性痙攣等異常行為。腦脊液生化分析顯示，氧化應激標志物及谷胱甘肽s轉移酶有所增加，而谷胱甘肽和谷胱甘肽過氧化酶減少，海馬體和其相鄰白質的星形膠質細胞聚集和小神經膠質細胞活化均不同程度增強，這些均提示神經炎癥反應過程的參與。

1.4 抗體模型 最近有許多研究表明，孕婦的免疫反應對胎兒的發育有很大的損害。在孕期母親的IgG可經胎盤為胎兒提供被動免疫，然而保護和致病的抗體都會從這一途徑傳給胎兒，如果母親存在自身免疫性疾病或者抗原，那么在孕期或是之前就會激活自身抗體且流向靶組織。孕期的血腦屏障正在發育，母親產生的自身抗體對胎兒的損害可能是一些先天性發育障礙的根源［26］。兩組小鼠分別靜脈注射來自孤獨癥患兒母親和正常兒童母親的腦反應性IgG抗體，觀察每組子代從生后8天到65天的生長和行為表現，結果顯示妊娠期暴露于孤獨癥患兒母親IgG抗體中的小鼠的子代存在感覺發育受損，焦慮增加［27］。此外，有實驗［28］分別將妊娠小鼠暴露于來自孤獨癥患兒母親體內所產生的IgE13－IgE18及IgG中，子宮內給予IgG的小鼠在青少年期對新鮮事物的反應較活躍，而成年鼠在高架十字迷宮中表現出焦慮樣行為，且對外界刺激反應較強烈。上述結果證明孤獨癥患兒母親所產生的IgG可以導致長期的行為異常。

2 遺傳學模型

眾所周知，遺傳因素能增高孤獨癥的發生危險。迄今為止發現與孤獨癥的發病有關的有130多個基因，這些相關基因主要在五個方面顯示出異常：神經元遷移相關基因；神經細胞離子轉運相關基因；神經遞質相關基因；突觸形成及突觸功能基因及相關的細胞黏附分子基因，本文就一些比較常見、重要的基因予以描述。

2.1 FMR－1基因模型 脆性X染色體綜合征（Fragile X syndrome，FXS））的癥狀包括精神發育延遲，社會交往障礙、焦慮、多動及刻板行為等，是引起孤獨癥的一個較常見的遺傳因素。一般認為，這種表現是由于FMR－1基因缺失及突變或者脆性X染色體發育遲滯蛋白（Fragile X mental retardation protein，FMRP）低表達所致。在脆性X染色體小鼠模型的實驗中，FMRP的低表達突觸蛋白的過度合成，導致了突出功能障礙［29］。FMR－1基因敲除的小鼠表現出刻板行為、社會交往障礙、焦慮、易怒等孤獨癥的核心特點，并且亦有實驗比較該基因敲除小鼠與野生型小鼠的差別，發現FMR－1基因敲除的小鼠的社會交往能力明顯低下［30，31］。FXS的表現可能由于二者都是由于腦神經元回路中的興奮和抑制失衡所致，因為此動物模型中過度的興奮導致了認知功能的減低。然而，Budimirovic［32］等人回顧了當前診斷為ASD的脆性X染色體綜合征的人類病例和FXS動物模型的關于行為學、神經生物學、分子學的研究狀況，發現其神經生物學及分子學方面的資料還很少，且動物模型尚不能反映出FXS診斷為ASD的特異性［32］。

2.2 MeCP2基因模型 RETT綜合征也是一種與孤獨癥有很多相似癥狀的基因病。它是由于MeCP2基因突變引起的，患者都是女性，具有嚴重的精神發育延遲、癲癇發作、手的刻板運動等孤獨癥的特點。在MeCP2雌鼠模型中，16周齡時出現異常，這些老鼠表現出在野外活動減少，筑巢減少和社會交往異常。令人驚奇的是MeCP2基因過度表達的小鼠，原本在10－20周齡時日益增強的活動和交往學習能力隨著時間的推移漸漸減退，而且出現活動減少、癲癇及前肢蜷縮，這些倒退的表現與人類極其相似［33］。而且，在 MeCP2基因敲除的成熟或未成熟模型中修復此基因的表達可以逆轉上訴癥狀［34］。

2.3 RELN基因模型 RELN基因定位于7q22染色體座位上，它的編碼產物Reelin蛋白參與大腦皮質、海馬、小腦和幾種腦干神經核的發生。在胚胎期引導神經元到達腦內指定的位置，成年后參與信號級聯放大從而影響突觸的可塑性、記憶及認知能力。RELN基因是一種引導神經元遷移的細胞外基因，有實驗［35］運用基因組連鎖分析，在神經病理學和神經影像學功能方面研究孤獨癥家族特點。發現巨腦、大腦生長快慢、神經元增長、大腦邊緣系統腦細胞縮小、小腦浦肯野細胞數量減少與孤獨癥有關，這為明確孤獨癥患者大腦皮層的基本結構、丘腦皮層的改變、皮質束組織畸形，皮質束抑制及大腦的興奮調節系統的功能障礙的基礎提供新的研究手段，有望成為孤獨癥病理學基礎。Laviola［36］等建立了RELN基因缺陷的Reeler雜合小鼠的初步模型，研究小鼠神經行為障礙的早期指標能否被識別，判定模型的可信程度。研究者將Reeler小鼠暴露于毒死蜱中觀察其忍耐程度和神經行為學表現，分析早期母體隔離的后果，發現早期的焦慮可轉變為后期的行為改變，但取決于小鼠的性別和遺傳背景。實驗還觀察了應用麻醉劑后的雜合子小鼠的減輕焦慮、興奮性增加、痛閾改變等反應，發現了一系列前所未有的大腦多巴胺能、血清激活素和阿片類藥物系統的變化。該模型的這些復雜的行為和精神藥理學表現可對明確基因改變與環境因素的關系、模擬精神疾病發病機理奠定基礎。

2.4 15q11－13染色體異常模型 染色體異常占致孤獨癥病因的6%－7%，而在這其中有1%－3%是由于母體15q11－13染色體區域的重復。這段染色體區域基因呈特征性表達，若他們發生突變，產生的結果取決于親代的染色體序列，現有研究表明，母體15q11－13區域缺失可導致AS，父親15q11－13區域缺失可導致Prader－Willi綜合征［37］。有研究已經使用染色體技術制作出了在第7號染色體上帶有特定區域重復的小鼠模型，從父系繼承該段染色體異常的小鼠表現出自閉癥樣癥狀，如缺乏社交能力、行為靈活性欠佳、異常尖叫及焦慮等。分子水平研究顯示，此段染色體的重復區域中的MBI152的改變可以影響五羥色胺2c受體發生變化，從而導致細胞內鈣的變化。該模型模仿了人類孤獨癥的許多特征，驗證了染色體異常與孤獨癥的相關性［38］。

2.5 FOX2基因模型 在對KE家族的神經生物學研究中發現，該家族一半成員的語音和言語嚴重受損，并且確定了是由于7q31染色體的FOXP2基因（與DNA有2個結合位點的包含多聚谷氨酰胺段的轉錄因子）引起。基于相關性研究，發現在孤獨癥及某些語音損害的疾病中FOXP2是一個損害語言功能的基因。在這個研究中破壞小鼠兩個FOXP2基因位點導致小鼠嚴重的運動神經損傷、過早死亡、缺乏尖叫聲及排斥母鼠等表現，而破壞一個基因位點導致了輕度的發育遲緩和嚴重的尖叫聲減少這種分離現象。此外，他們還發現此模型小腦中的浦肯野細胞損害嚴重。推斷FOXP2基因在小腦發育及某些存在社會交流的生物的發育過程中起到很關鍵的作用［39］。由于ASD患者成熟的顳葉皮層MET蛋白呈低表達，為了研究MET基因與ASD神經發育情況的關系，Zohar［40］等人測定了MET蛋白的表達及控制其轉錄與表達的FOXP2基因，發現妊娠中期后代的小腦顳葉及枕葉皮質中的MET蛋白的表達顯著減少。在顳葉皮質區中MET蛋白被FOXP2基因替代，提示FOXP2基因可能抑制了MET蛋白的表達。在后續實驗中正常人神經干細胞中的MET和FOXP2也呈現出競爭抑制現象，更加證明了FOXP2控制MET的轉錄。實際上FOXP2結合于MET的5＇端，而它的超表達導致了MET轉錄減少。這些都為ASD的發病提供了遺傳學證據。

綜上所述，孤獨癥是一種及其復雜的發育障礙，與多種因素密切相關。目前雖然已經發現了很多易感因素，但還未徹底揭開這個秘密。顯然動物模型是研究孤獨癥發病原因和治療手段必不可少的工具，擁有廣闊的前景，然而當前的孤獨癥模型還存在模型成功的評價標準不一、可重復性較差、操作復雜等等許多問題，研究者要考慮表面效度、構建效度和預測效度等多方面因素，才能構建出切實有效的動物模型。

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