膠質瘤源性Exosome的研究進展

王立威，孫玉學，張 博，黃海燕，吳宣萱＊

（1.長春市人民醫院 伽瑪刀中心，吉林 長春130051；2.吉林大學白求恩第一醫院 神經腫瘤外科，吉林 長春130021）

腦膠質瘤起源于腦部神經膠質細胞，是最常見的顱內腫瘤，有逐年增長的趨勢。膠質母細胞瘤患者的平均存活期小于15個月［1］。數十年來，盡管手術治療、放射治療以及生物化學治療在臨床上普及應用，但是患者的生存期未見明顯延長［2］。1987年，Johnstone等首次用exosome來描述網織紅細胞分泌的這種囊性小泡，這種囊性小泡在網織紅細胞的最后階段把不必要的膜成分排除胞外［3］。后來陸續發現 B細胞［4］、T 細胞［5］、樹突狀細胞［6］、腫瘤細胞均可分泌exosome，腫瘤患者的血清、腹水、胸水等亦有exosome，特別是膠質瘤細胞源性exosome含有 mRNA、miRNA［7］、線粒體DNA、熱休克蛋白（HSPs90，70，60和27）、EGFRvIII和 TGF－1［8］等生物大分子，具有重要的研究意義。腫瘤源性exosome含有這些特殊的分子物質，對闡述線粒體疾病有一定的意義，可推動腫瘤的免疫治療。

1 Exosome概述

Exosome，又稱外切酶體、微粒體，起源于晚期核內體，由30－100μm大小的小囊泡在多聚體內（MVBs）聚集而成［9］。多數多聚體被溶酶體酶水解；一部分多聚體與細胞質膜融合釋放小囊泡到細胞外，形成exosome。細胞通過釋放exosome來排出胞內的毒性物質，包括殘留的化學治療劑，病毒以及信使RNA和微小RNA［10］。Graner，M.W.等已經證實人類與鼠的膠質瘤細胞都可以分泌exosome［11］。在癌癥病人的惡性滲出液［12］、腹水［13］以及血清［14］中也存在 exosome。Michael W.Graner［8］等人通過電子顯微鏡觀察發現膠質瘤源性exosome是由50－100納米的囊性小泡組成的，含有熱休克蛋白。Michele Guescini等人研究證實了exosome還有線粒體DNA［15］。下面我們從三個方面來探討膠質瘤源性的exosome的生物學性質、相應的功能以及對基礎醫學和臨床醫學的實踐意義。

2 Exosome蛋白質組學研究

蛋白質組學，早在1995年由Marc Wilkins提出這一概念［16］。經過十余年的發展，蛋白質組學已發展為通過雙向凝膠電泳、生物質譜技術以及生物信息學等方法在大規模水平上研究蛋白質特征（包括蛋白質的表達水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白相互作用）的一門學科，用于蛋白質的鑒定，研究蛋白質功能，由此獲得蛋白質水平上的關于疾病發生、細胞代謝等過程的整體而全面的認識。

Hiratsuka等 利 用 2－DE 和 MALDI－TOF－MS技術，在膠質瘤中鑒定出了11種上調的蛋白質和一種下調的細胞骨架相關蛋白－SIRT2。Honda等應用非平衡PH梯度凝膠電泳分離多個膠質瘤細胞系的水溶性蛋白質，結果發現人和鼠的膠質瘤細胞系蛋白圖譜存在顯著不同。Iwadate等應用2－DE和MALDI－TOF－MS技術對膠質瘤標本進行分析，根據2－DE結果對膠質瘤的蛋白表達譜進行聚類分析，發現聚類分析的結果與病人生存率和生存時間有明顯的相關性，進行 MALDI－TOF－MS分析，鑒定了25種蛋白質，分別屬于信號轉導蛋白、分子伴侶蛋白等。Michael W.Graner等人用二維聚丙烯凝膠電泳研究膠質瘤源性exosome和SMA560vIII源性exosome所含蛋白質［8］，根據其在電解槽中不同的移動速度分離出45種蛋白質，包括HSC90、70、60、27，與免疫相關的抗PDI抗體、肌動蛋白、CD171、CD40、干擾素、白介素6、白介素1，與信號轉導相關的DNA／RNA蛋白、轉運蛋白、分子伴侶、蛋白酶或者蛋白酶抑制劑，特異的蛋白質包括抑制蛋白2，3－DPGH、凋亡蛋白、CENP－P （#26）、唾液酸合酶、eIF3、PCNA、MT 磷酸酶、EF－1、蛋白酶體和ALIX（一種蛋白質，exosome的標記蛋白）。研究結果顯示，其含的蛋白質有的跟人類H2159MG exosome所含蛋白質相同，一部分為其自身所特有。Johan Skog［17］等人通過研究發現惡性膠質瘤患者exosome中含有血管源性蛋白。

蛋白質組學研究顯示了膠質瘤源性exosome蛋白質大多數是多功能蛋白質，具有酸性等電點，是與酶及新陳代謝有關的物質。這些蛋白質大部分是低聚復合物，分別是大分子蛋白、TCP－1／HSP60、蛋白酶體、肌動蛋白、微管蛋白、40S的核糖體蛋白、延長因子、轉化因子、鐵蛋白以及糖酵解中的四種酶。NF－κB和ApoA－1的關系在脂質的新陳代謝中起著重要作用［25］。ApoA－1通過exosome運送到各種細胞或者從細胞中釋放，都受控于NF－κB的狀態和細胞脂質的生物化學性質。烯醇酶和肌動蛋白是細胞表面血纖維蛋白溶原酶和血管生成抑制因子的受體。烯醇酶和生長因子的關系，說明生長因子可能與糖酵解相關的蛋白有相關性，生長因子對糖酵解有一定的影響。這些蛋白質低聚復合物是由exosome體內的蛋白質聚集而成的。有文獻報道，很多病毒蛋白與exosome蛋白相似，很難區分病毒顆粒與exosome。有學者從膠質瘤患者中發現了人巨細胞病毒，在外周血中發現了HCMV DNA［26］。有人推測來自膠質瘤患者的HCMV DNA可能來自exosome，有待研究。

Michael W.Graner等［8］人用Ingenuity軟件分析了其蛋白質路徑，最高的兩種被描述為“血液的、免疫的、呼吸系統的疾病”和“細胞間信號傳遞、癌癥、血液病學的發展”。結果證明，不同來源exosome蛋白質之間有密切的關系，同時有很多信號蛋白存在于腫瘤細胞中，特別是腦腫瘤，并發現很多exosome蛋白與免疫有關，如CD40、干擾素、白介素6、白介素1。這些相關性凸顯了exosome存在著正常和病理兩種細胞狀態。

3 Exosome免疫學研究

通過對膠質瘤源性exosome所含蛋白質的研究發現，其中很多蛋白質是與免疫有關的蛋白質，如HSP、EGFRvII、CD40、干擾素、白介素6和白介素1。

Exosome表面HSP有助于抗原提呈細胞或者自然殺傷細胞的免疫反應；另一方面，細胞表面HSP2724與腫瘤的浸潤性生長有關，所以關于exsome表面HSP的研究越來越受關注。HSP27存在于exosome的表面，exosome類似于細胞，細胞表面蛋白能變成exosome表面蛋白。如果exosome能隨血液或者腦脊液在體內流動，那么Exosome表面的HSP27，同時也可作為腫瘤表面抗原，亦可作為腫瘤標記。從膠質瘤患者血清中分離出exosome，證明了exosome含有EGFR和EGFRvIII、HSP／HSC70、TGF－＿1。EGFRvIII和 TGF－＿1用于區別是來自腫瘤源性的exosome還是來自病人的血清，亦可作為腫瘤標記。Exosome可以在尿液和羊水中提取，可以用exosome含有的核酸作標記。

從病人和正常人血清中分離出的exosome含有EGFR，而從膠質瘤患者exosome中可發現EGFRvIII，在正常人血清中是不存在的。正常人的exosome含有HSP／HSC70和EGFR，不含EGFRvIII和TGF－＿1。TGF是一免疫調節因子。EGFRvIII這種變異的受體容易被激活而導致癌癥的發生，同時可作為腫瘤抗原，引起相關免疫反應［18］。EGFR－vIII和TGF－＿1是膠質瘤所特有的，可作為生物標記，同時它們具有免疫特性，包括抗原性和抑制免疫。EGFRvIII抗原有利于分析膠質瘤產生exosome的過程，也可使我們在體外建立膠質瘤產生exosome的模型。EGFRvIII可以根據相關信號的激活路徑轉移到不含EGFRvIII的超微小泡中去。

很多報道稱腫瘤源性的exosome具有免疫抑制力［19］，TGF在免疫抑制中起重要作用，免疫抑制的靶細胞包括自然殺傷細胞［20］，效應 T 細胞［21］，抗原提呈細胞［22］。高度惡性膠質瘤患者的免疫系統是受到抑制的，推測exosome可能跟免疫抑制有關。免疫抑制和免疫促進的平衡點取決于exosome，免疫反應是由內在和外在的因素共同決定的。Exosome的抗原和免疫刺激是很重要的，但更重要的是免疫調節功能，比如FAS配體、脂肪、病毒，甚至TGF調節因子。Michael W.Graner等［8］人通過對鼠的研究發現，exosome實際上能產生免疫刺激，包括T細胞和抗體的產生，但不能延長鼠的存活期。活體中的exosome能產生抗體。但是，如果很難接近腫瘤組織，或者有一種類似腫瘤的組織來結合抗體，這樣就不能起到抗腫瘤的作用。因此，在這種情況下，exosome產生的免疫反應不足以抑制腫瘤的發生。也有報道稱exosome能引起保護性抗體反應，抑制腫瘤表達SARS病毒蛋白，這些exosome都來自在經抗病毒免疫的人類細胞株［23］。抗體的產生以及細胞毒性T細胞的減少有益于腫瘤的治療。膠質瘤源性exosome具有抗炎的作用和產生免疫調節作用，能減少腫瘤免疫反應，能夠給我們提供新的治療方法治療嚴重的疾患。

4 Exosome分子生物學研究

Exosome，亦稱外切體，是因為在酵母中的exosome具有一個具有3’，5’－外切核酸酶活性的復合物，參與了多條RNA的代謝途徑，包括mRNA和pre－mRNA的周轉，5.8sRNA的加工，多種snRNA及snoRNA的加工等［28］，在膠質瘤exosome中尚未發現。Johan Skog等［17］人研究證實了惡性膠質瘤患exosome含有 mRNA，miRNA。Michael W.Graner等［11］人在膠質瘤細胞分泌的exosome中發現了與RNA轉錄有關的起始因子和延長因子eIF3，EF－1。Michele Guescini等人［27］通過PCR技術發現了exosome中含有線粒體DNA，這些與基因有關的分子的發現將會開啟膠質瘤新的研究方向。

在膠質瘤中發現對基因研究有重要意義，mRNA和miRNA可作為基因探針或腫瘤標記，有助于膠質瘤的診斷。Exosome中的線粒體DNA有望成為基因克隆的載體，制備腫瘤疫苗，有待于進一步研究。Exosome中是否含有線粒體蛋白質尚不清楚，但Staubach［29］已在乳腺癌exosome中發現了線粒體蛋白質。

4 展望

自從發現exosome以來，人們對它的研究從未間斷，希望通過對膠質瘤源性exosome的研究為膠質瘤治療提供新的方法。目前，樹突狀細胞性exosome作為細胞疫苗已進入第一臨床階段實驗。膠質瘤源性的exosome，是一種亞細胞成分，富含HSP、EGFRvII等多種生物活性分子，在適當的條件下可持續發揮長期穩定的免疫調節作用，由于其體積小，易保存，穩定高效，且為非細胞性物質，集中了DC疫苗和非細胞載體的優勢，因而有望取代DC成為一種新的免疫治療手段，在非細胞性疫苗生物治療方面前景廣闊。Exosome富含各種信號轉導分子，可以將相應的信號從胞內帶到胞外，引起細胞周圍各種信息的交換。在基礎研究中，發現exosome含有線粒體及與真核生物有關的轉錄因子，在解釋線粒體疾病、基因轉錄調控以及克隆方面起到一定的作用。

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