核仁磷酸蛋白基因突變檢測及其臨床意義

馬 亮，殷獎悠，湛玉良

（中日友好醫院 檢驗科，北京 100029）

隨著基因組學的發展，對白血病分子遺傳學及分子生物學的研究不斷深入，發現急性髓細胞白血病（acute myelocytic leukemia，AML）中存在多種不同的基因突變和基因表達的改變，目前對核仁磷酸蛋白基因1（nucleophosmin family，member 1，NPM1）研究較多，該基因突變與患者的臨床表現和預后有很大的相關性，現作一綜述。

1 NPM的結構和生物學功能

核磷素（nucleophosmin，NPM），也稱為核仁磷酸蛋白B23或核仁間質蛋白，包括NPM1、NPM2及NPM3 3種亞型。NPM1是位于核仁顆粒區的主要蛋白分子之一，能穿梭于核仁、核質和胞質之間，參與核糖體前體運輸和合成及中心體的復制，進而調控細胞的周期進程和增殖發育[1]。人類NPM1基因位于染色體5q35，基因全長約23kb，含有12個外顯子，編碼由294個氨基酸組成的蛋白質。在分子結構上NPM可分為3個區域，分別負責不同的功能[2]，由N端開始，NPM蛋白包含一個疏水區，它參與寡聚化過程，并與NPM分子伴侶活性相關。隨后2個富含天冬氨酸和谷氨酸的酸性區，是與組蛋白結合的關鍵結構。在兩個酸性區是核糖核酸酶活性區，與C端的核酸結合結構域一起構成核糖核酸酶活性結構域。NPM主要定位在核仁顆粒區，可通過核仁定位信號在核仁、胞核和胞質之間往返，參與核質間物質的運輸。

NPM具有多種生物學功能。一方面，NPM在rRNA前體加工過程中發揮核糖核酸內切酶的活性，參與28S rRNA的形成，進而促進核糖體的形成，同時NPM可作為細胞周期依賴性蛋白激酶2（CDK2）/細胞周期蛋白E復合物的直接底物，被CDK2/cyclin E磷酸化，并從中心體中解離出來，啟動中心體復制，在調控周期進程和促進細胞增殖中發揮著重要作用。另一方面，NPM可以與HIV-Rev等帶有核定位信號的蛋白質結合，促進它們運輸至核仁并阻止核仁內多種蛋白質的聚集，還可以結合組蛋白，介導核小體的合成和致密染色質的舒展，發揮分子伴侶功能[3]。

2 NPM1突變發現及突變類型

Falini等[4]首先通過免疫組織化學方法對591例AML患者NPM基因表達的研究中發現，其中208例患者 （占35.2%）白血病細胞胞漿中檢出NPM蛋白，NPM基因突變導致大量的NPM分子從核仁移位至胞漿，因此把基因突變致NPM胞漿移位的白血病細胞稱之為NPMc+細胞。這種 NPMc+細胞分布在除 M3、M4EO、M7以外的其它 AML FAB各亞型中，但在不同FAB亞型中突變率不同，如M2中約為20%，M4中為40%～50%，M5a中為40%～50%，M5b中則高達90%。可見，其與單核細胞關系較為密切[5]。經測序證實為NPM1基因第12外顯子突變導致NPM蛋白核定位改變。

NPM突變的類型：NPM突變基因是雜合型的，在基因座上保留了1個野生型的等位基因。目前發現有多種NPM1基因突變，都是由在外顯子12的不同位置插入不同的核苷酸而產生，主要以6種變異體（mutation A-F）為主，其中最常見的是mutation A，它是在野生型NPM核苷酸序列第956-959位上插入1個TCTG 4個核苷酸而形成串聯重復序列；mutation B、C、D是在野生型NPM核苷酸序列上第960位之前插入4個不同堿基而產生；而mutation E、F是由于缺失了野生型NPM核苷酸序列第965-969位上的GGAGG堿基序列，但隨后插入了2種不同的9個堿基的序列而產生[6]。 Mutation A-F導致NPM1基因外顯子12的移碼突變，使NPM蛋白C末端的7種氨基酸色（W）-谷（Q）-W-精（R）-賴（K）-絲（S）-亮（L）被 11 個短肽鏈X-X-X-X-X-X-纈 （V）-S-L-R-K或13個短肽鏈 W-Q-天冬（D）-苯丙（F）-L-門冬（N）-R-L-F-K-K-異亮（I）-V所代替，從而導致NPM蛋白C端的288和290位點上至少有1個色氨酸發生突變而產生一個核輸出信號（NES），最終使NPM移位到胞漿。

Nakagawa等[7]進一步研究提出，在野生型NPM分子結構中C端的色氨酸只對NPM的核仁定位起主要作用，而對NPM的胞漿移位不起主要作用；他同時還提出在突變NPM的C端中存在一種核輸出信號序列（NES），由疏水性氨基酸殘基所組成。NES中的分子被輸出信號受體CRM1所識別，從而產生核輸出信號，導致NPM移位到胞漿。在野生型NPM的N端92-104位點有一個生理性的NES序列，若將此NES序列敲除或將C端突變產生的NES序列敲除，然后將NES序列敲除的NPM基因轉染入NIH3T3細胞，發現無論敲除N端還是C端的任意一種NES序列，NPM都只能出現在核質而不能聚集在胞漿中，這說明突變NPM只有在同時具有兩種NES序列的情況下才能實現其胞漿的聚集。

3 NPM1突變檢測

關于NPM1突變的檢測，目前應用的主要方法有PCR-毛細管電泳、變性高效液相色譜（DHPLC）、直接測序、實時熒光定量PCR（Q-PCR）以及免疫組化檢測胞漿中NPM蛋白等方法[9，12]，這幾種檢測方法各自有其優缺點。近年來DHPLC、毛細管電泳和RQ-PCR作為檢測基因突變方法，以其靈敏度高、自動化、快速高效、準確等優勢漸漸成為各種基因突變檢測方法中常用的可靠方法。直接測序作為檢測基因突變的“金指標”，隨著靈敏度不斷提高、檢測的成本進一步降低，該方法也逐漸普及。

DHPLC：是在PCR產物的基礎上進行的。NPM1基因突變為雜合子，PCR擴增的基因不僅包括突變基因，還包括未突變等位基因。如果正常基因和突變基因在試管內變性雜交，DHPLC的圖譜上會出現有別于正常基因的構象，出現不同的峰型，由此可以辨別是否有突變。Roti等[8]認為該方法檢測突變高度敏感、可靠，并且只需對PCR產物直接檢測，因而快速廉價。但鄒積艷等[9]發現，DHPLC檢測結果受較多因素影響，雖然多次更換條件，部分突變患者的峰型并不典型，最終的判斷很容易出現假陰性。

毛細管電泳：是在基因序列分析儀上做毛細管電泳檢測來分析PCR基因產物[10]。毛細管電泳法是用熒光標記PCR產物，觀測PCR獲得的基因片段在毛細管電泳圖上顯示的長度，還可根據峰面積定量檢測突變型與野生型的比率。并且需要的樣本量很小，可對多重PCR產物同時檢測而不影響結果的準確性，但是，毛細管電泳要求擴增產物不能太長（一般＜500bp），否則會影響其準確性，另外該方法需要價格昂貴的基因序列測定儀。作為一種快速的定性檢測方法，毛細管電泳具有很大的優勢。

Q-PCR：可以精確地做基因定量，從而估計突變細胞在患者體內的數量。Q-PCR基因定量往往用于檢測治療后的白血病微小殘留病（MRD）。臨床治療要求檢測MRD的靈敏度達到惡性細胞占1/105～1/106個細胞的水平，并且要求快速、價廉、易于標準化質量控制，在不同實驗室可以重復。Q-PCR完全可以達到要求，使臨床工作中對患者不同病期、不同實驗室的檢測結果有了可比性[12]。Q-PCR有多種模式：Taqman探針法、熒光染料法、分子信標法等，但Q-PCR只能針對NPM1已知基因突變類型檢測。

PCR產物的直接測序：是檢測基因突變的“金指標”。其往往受到基因組DNA同時存在正常（野生型）等位基因和突變等位基因片段混雜在一起的影響，需要對PCR產物進行凝膠純化，步驟較繁瑣，而且突變基因含量較低時，直接測序往往很難檢測到突變，靈敏度相對較低。

免疫組化：該方法簡便易行，可同時觀察細胞形態及分布，適用于標本取材較少或髓外組織活檢等情況。有3種抗體可用于NPM的免疫組化檢測[13]。一種為標記NPM的單克隆抗體，但其不能區分NPM突變型與野生型，只能通過其細胞定位（野生型位于細胞核，突變型位于胞漿）區分。此種抗體目前應用最廣泛。另一種為多克隆抗體，可識別NPM突變型，但其診斷敏感性僅為50%～60%，因其高度特異性而主要應用于NPMc+AML細胞系研究。第3種單克隆抗體只識別野生型NPM，此種單克隆抗體診斷意義不大。Falini等[13]分析200例NPM1基因突變患者，通過免疫組化方法檢測NPMc+，其中195例呈強陽性，5例呈弱陽性。對照250例野生型NPM1均為陰性。其缺點是不能準確定量，對NPM1陰性檢測缺乏準確性。

另外，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳也是檢測NPM1突變的一個比較好的方法，在普通聚丙烯酰胺凝膠中加入變性劑如尿素等，可去除單鏈DNA的構象變化，使電泳的單鏈遷移率只由DNA的長度決定，從而可以分辨不同DNA標本間的細微堿基數量差別。

4 NPM1檢測的臨床意義

Thiede等[14]進行的大規模臨床研究結果顯示，在1485例AML患者中有408例（27.5%）存在4個核苷酸插入的NPM1突變，并且發現了13種新突變。核型正常者NPM1突變發生率（45.7%）明顯比核型異常者（8.5%）高，且表現為骨髓中原始細胞比例高、高白細胞和血小板，髓外浸潤易見。進一步研究發現，在成人女性AML患者，NPM1突變發生率比男性患者要高1.5倍，提示存在性別差異。在兒童AML患者中，NPM1的發生率為2.1%～6.5%，在兒童AML-NK 患者發生率為 9%～26.9%[15，16]，而在成人 AML 患者中為25%～35%，在成人AML-NK患者中則高達45.7%～63.8%[17]，表明在兒童AML中NPM發生突變的可能性比成年病例要低得多。值得注意的是，兒童AML患者往往出現NPM-mtA以外的突變型，他們在性別和白細胞計數方面與NPM-wt患者沒有顯著的差異。

NPM1突變在慢性粒細胞白血病患者中并不常見。Caudil等[18]研究發現，在CML患者中一旦出現了NPM1突變，提示CML極有可能短期內迅速發展為AML，患者預后較差。Zhang等[19]在38例原發性骨髓增生異常綜合征患者中，發現2例NPM1突變，分別是難治性貧血（RA）和難治性貧血伴原始細胞增多。這2例患者雖表現異常核型，但均未涉及NPM1所在的5號染色體的改變。

關于在中國AML人群中NPM1的發病率，2個研究發現[20，21]，中國 AML患者 NPM1突變率分別為 16.4%與28.2%，前者應用Q-PCR的方法，主要檢測的是NPM1A、B、D型突變，而后者采用的是毛細管電泳的方法，篩查NPM1所有類型突變。相對于國外研究，NPM1在中國AML患者發生率明顯低于國外。

Schnittger等[22]提出，可以把 NPMc+作為 AML預后良好的因素之一。然而，NPM1突變近40%的AML患者同時存在NPM1和FLT3-ITD基因突變，而在藥物誘導AML緩解的試驗中，發現FLT3-ITD突變能降低完全緩解率，因此單純NPMc+的AML患者預后較好，若同時伴隨FLT3-ITD突變，將會影響AML患者對化療藥物誘導的緩解效果[23]。Koh等[24]認為，FLT3-ITD陰性、預后良好的NPM1突變是在956-959位點具有經典TCTG插入的A型，其他非A型突變患者的中位生存期和總生存期較A型突變患者短。

另外，研究發現NPM1突變可以作為監測MRD的新指標。利用Q-PCR檢測突變NPM基因cDNA拷貝數，從而監測MRD。在13例NPM1突變的AML患者中，突變NPM1基因cDNA拷貝數均＞30000。藥物治療后，其中10例獲得明顯緩解，其突變NPM1基因cDNA的拷貝數明顯下降，而藥物治療無效的3例患者其突變NPM基因cDNA拷貝數下降程度很小或不下降。這表明突變NPM基因cDNA拷貝數與患者的臨床狀況明顯相關[7]。NPM1基因突變穩定，對2組AML復發者的研究發現，17例患者中的15例和15例患者中的10例NPM1基因突變持續存在[25]。通過定量PCR檢測NPM1基因突變，顯示其穩定性與疾病臨床進程密切相關[26]。因此，NPM1基因檢測可用于治療后監測疾病復發及微小殘留病變檢測。

[1]Grisendi S，Mecucci C，Falini B，et al.Nucleophosmin and cancer[J].Nat Rev Cancer，2006，6（7）：493-505.

[2]Hingorani K，Szebeni A，Olson MO.Mapping the functionaldomains of nucleolar protein B23[J].J Biol Chem，2000，275（32）：24451-24457.

[3]Lindstrom MS，Zhang Y.Ribosomal protein S9 is a novel B23/NPM-binding protein required for normal cell proliferation[J].J Biol Chem，2008，283：15568-15576.

[4]Falini B，Mecucci C，Tiacci E，et al.Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype[J].N Engl J Med，2005，352：254-266.

[5]Gale RE，Green C，Allen C，et al.The impact of FLT3 internal tandem duplication mutant level，number，size，and interaction with NPM1 mutations in a large cohort of young adult patients with acute myeloid leukemia[J].Blood，2008，111（5）：2776-2784.

[6]Gorello P，Cazzaniga G，Alberti F，et al.Quantitative assessment of minimal residual disease in acute myeloid leukemia carrying nucleophosmin （NPM1）gene mutations[J].Leukemia，2006，20：1103-1108.

[7]Nakagawa M，Kameoka Y，Suzuki R.Nucleophosmin in acute myelogenous leukemia[J].N Engl J Med，2005，352：1819-1820.

[8]Roti g，Rosati R，Bonasso R，et al.Denaturing high-performance liquid chromatography:a valid approach for identifying NPM1 mutations in acute leukemia[J].J Mol Diagn，2006，8：254-259.

[9]鄒積艷，朱平，劉紅星，等.白血病NPM1基因突變檢測方法的臨床適用性比較[J].中華檢驗醫學雜志，2009，32（1）：35-39.

[10]Szankasi P，Jama M，Bahler DW.A new DNA-based test for detection of nuclephosmin exon 12 mutations by capillary electrophoresis[J].Diagn，2008，10：236-241.

[11]Abdel Rahman H，Farrag SA，El-Attar IA.AML1/ETO fusion gene in de novo pediatric acute myeloid leukemia:clinical significant prognostic implications[J].J Egypt Natl Canc Inst，2007，19：39-47.

[12]Falini B，Bolli N，Shan J，et al.Both carboxy-terminus NES motif and mutated tryphophan （s）are crucial for aberrant nuclearexportofnucleophosmin leukemia mutants in NPMc+AML[J].Blood，2006，107（11）：4514-4523.

[13]Falini B，Martelli MP，Bolli N，et al.Immunohistochemistry predicts nucleophosmin （NPM） mutations in acute myeloid leukemia[J].Blood，2006，108（6）：1999-2005.

[14]Thiede C，Koch S，Creutzig E，et al.Prevalence and prognostic impact of NPM1 mutation in 1485 adult patients with acute myeloid leukemia （AML）[J].Blood，2006，107：4011-4020.

[15]Thiede C，Creutzig E，Reinhardt D，et al.Different types of NPM1 mutations in children and adults:evidence for an effect of patient age on the prevalence of the TCTG-tandem duplication in NPM1-exon 12[J].Leukemia，2007，21：366-367.

[16]Brown P，Mclntyre E，Rau R，et al.The incidence and clinical significance of nucleophosmin mutations in childhood AML[J].Blood，2007，110：979-980.

[17]Renneville A，Roumier C，Biggio V，et al.Cooperating gene mutations in acute myeloid leukemia:a review of the literature[J].Leukemia，2008，22：915-931.

[18]Caudil JS，Sternberg AJ，Li CY，et al.C-terminal nucleophosmin mutations are uncommom in chronic myeloid disorders[J].Br J Haematol，2006，133：638-641.

[19]Zhang Y，Zhang M，Yang L，etal.NPM1 mutations in myelodysplastic syndromesand acute myeloid leukemia with normal karyotype[J].Leuk Res，2007，31：109-111.

[20]Ruan GR，Li JL，Qin YZ，et al.Nuclephosmin mutations in Chinese adults with acute myelogenous leukemia[J].Ann Hematol，2009，88：159-166.

[21]Yan LZ，Chen SN，Liang JY，et al.Analysis of NPM1 gene mutations in Chinese adults with acute myeloid leukemia[J].Int J Hematol，2007，86：143-146.

[22]Schnittger S，Schoch C，Kem W，et al.Nucleophosmin gene mutations are predictors of favorable prognosis in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype[J].Blood，2005，106：3733-3739.

[23]Choudhary C，Schwable J，Brandts C，et al.AML-associated FLT3 kinase domain mutations show signal transduction differences compared with FLT3 ITD mutations[J].Blood，2005，106（1）：265-273.

[24]Koh Y，Park J，Bae EK，et al.Non-A type nucleophosmin 1 gene mutation predicts poor clinical outcome in de novo adult acute myeloid leukemia:differential clinical importance of NPM1 mutation according to subtype[J].Int J Hematol，2009，90（1）：1-5.

[25]Boissel N，Renneville A，Biggio V，et al.Prevalence，clinical profile，and prognosis of NPM mutations in AML with normal karyotype[J].Blood，2005，106（10）：3618-3620.

[26]Chou WC，Tang JL，Wu SJ，et al.Clinical implications of minimal residual disease monitoring by quantitative polymerase chain reaction in acute myeloid leukemia patients bearing nucleophosmin （NPM1）mutations[J].Leukemia，2007，21（5）：998-1004.