靶向釋放智能納米載體的研究進展＊

顧君彤，徐維平，陸 楊 ，徐婷娟，黃向華，張勇強

(1.安徽中醫學院研究生部，安徽 合肥 230038; 2.安徽省立醫院，安徽 合肥 230001;3.中國科學技術大學，安徽 合肥 230026)

納米尺度的載體在藥物靶向釋放研究中的應用，為疾病的預防、診斷和治療提供了新的途徑。納米技術在生物應用、靶向藥物載體中具有獨特的優勢，可以有效地減少藥物在臨床治療中的副作用，并提高療效[1]。大多數抗腫瘤藥物在治療時不具有選擇性，也會殺傷正常組織，而納米載體可將藥物或基因靶向傳輸到人體中不同的治療部位，提高藥物在治療部位的有效濃度，提高細胞對藥物攝取率和藥物透過細胞膜的能力，降低不良反應發生率。

1 納米靶向傳輸系統

納米靶向傳輸系統是目前最理想、最有發展前途的給藥方式。它通過載體將藥物選擇性輸送到特定的靶向部位，然后載體解體并釋放藥物，分為納米主動靶向傳輸系統和納米被動靶向傳輸系統。

納米被動靶向傳輸系統是指納米載體對網狀內皮系統具有靶向性，藥物在特定的給藥部位聚集，使其可在肝臟和脾被動靶向釋放生物活性物質。刺激-響應型控制釋放給藥系統只有在信號刺激下納米載體才會釋放載附物。例如，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)或聚氧化乙烯(polyethylene oxide，PEO)修飾的長循環納米粒在靜脈注射給藥后，基于實體瘤的通透性和滯留效應(EPR效應)，使得載體在腫瘤組織周圍聚集[2]。

納米主動靶向傳輸系統是經過修飾的藥物載體定向靶向至特定的治療部位。由于腫瘤細胞增殖迅速，一些特定的受體表達增強，使細胞對葉酸、維生素和糖的攝取增加。配體修飾納米載體技術是對人體腫瘤細胞主動靶向的一個重要方法[3]。一些研究小組利用鐵離子結合-轉鐵蛋白對納米載體進行主動靶向修飾。

2 智能納米載體

納米載體由無機和有機的材料組成，包括可降解或不可降解的聚合物、類脂等自組裝，自組裝雙嗜性分子，樹枝狀高分子材料，金屬和無機半導納米晶體[1]。選擇何種材料作為載體主要依據診斷疾病的類型、治療的目的、材料的安全性、給藥的方式。近年來，將納米粒、脂質體、納米囊、納米膠束、樹枝狀高分子等作為藥物或基因靶向傳輸系統中的載體受到了學者的廣泛關注[4]。

智能納米載體亦稱刺激-響應型納米載體，是一種極具發展潛力的藥物載體，能夠滿足某些特定的釋放要求，能被人體內生物信號如pH、溫度、氧化還原電位等信號激發釋放藥物或基因治療片段到特定的部位[5]。此外，還有一些可以通過外界刺激信號(如磁場、光、聲)激發，靶向釋放藥物和基因片段。以下就刺激響應納米載體在藥物和基因靶向傳輸系統中的研究進展，尤其是近年來興起的智能載體—氧化-還原刺激響應納米載體展開介紹。

1)氧化-還原刺激響應型納米載體

細胞內的還原型谷胱甘肽(glutathiose，GSH)水平約是細胞外的100～1 000倍[6]，氧化-還原型納米載體是基于該區別設計的，也稱谷胱甘肽響應型納米載體。當納米載體進入細胞后，胞內的GSH濃度高于胞外，二硫鍵在還原環境中不穩定，隨即釋放藥物和基因治療片段，如阿霉素(dox-orubicin，DOX)、DNA質粒、RNA干擾片段、寡聚核苷酸等。

氧化-還原刺激響應型納米粒:納米粒(nanoparicles)是粒徑在1～1 000 nm之間的固態膠體粒子。Lai等[6]在2002年首先明確提出了氧化-還原刺激響應控制釋放體系的概念。在介孔內修飾2-丙基硫烷基乙胺活性功能基團的介孔硅(mesoporous silica nanoparticles，MSN)，載附萬古霉素后，與巰基乙酸的衍射物CdS通過二硫鍵進行連接。在以磷酸鹽緩沖液為釋放介質的體外累積釋放率試驗中，12 h后萬古霉素的體外累積釋放率小于1%;加入還原劑二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)后，體外累積釋放率達到了85%。Luo等[7]在 Lai研究的基礎上，制備了聚乳酸(lactobionic acid，LA)受體介導的LA-COL-linker-MSN型介孔硅，用異硫氰酸熒光素(FIFC)進行熒光標記。將 LA-COL-linker-MSN/FIFC納米粒與MSN/FIFC納米粒的HepG 2細胞攝取實驗結果進行比較，前者2 h透細胞膜的效率是后者3倍。

基因傳輸系統成功靶向至細胞的關鍵，是其在血液循環中具有高度穩定性，這可以通過聚合物分子鏈與聚合物納米載體之間形成共價鍵結合，即分子內和分子間的交聯，從而使聚合物納米粒穩定，避免解離和提前釋放質粒DNA。但殼聚糖高分子主鏈與巰基結合后易于氧化，在細胞內的還原環境中打開二硫鍵，釋放質粒DNA。但殼聚糖-巰基氨基丁烷-DNA納米粒在Caco-2細胞中轉染效率的研究表明，其作為基因傳遞系統中的新型載體具有良好的應用前景[8]。

氧化-還原刺激響應型脂質體:脂質體(lipsome)在生物醫學中應用廣泛，可作為藥物傳遞載體、生物傳感器和催化劑等，是為數不多的已經在臨床上使用的靜脈注射藥物的載體。氧化-還原刺激響應型脂質體作為實現靶向釋放的一種重要途徑，是由普通磷脂、親水基團和疏水基團通過二硫鍵連接的類脂組成。脂質體在血液循環中均很穩定，在還原環境下，二硫鍵還原成巰基，釋放脂質體內的組分[9]。Wanlop研究小組[10]制備的脂質體由1-(2，3-二油酰基)-N，N，N-三甲胺丙烷甲基硫酸鹽、磷脂酰膽堿、聚乙二醇組成，具有良好的生物安全性。將反義核苷酸G3139通過二硫鍵與脂質體連接，在人體口腔癌KB細胞內的還原環境中，二硫鍵還原成巰基，釋放出反義核苷酸G3139，從而降低了抑凋亡基因(bcl-2)的表達。二硫鍵修飾脂質體與未經二硫鍵修飾的脂質體相比，前者抑制bcl-2基因的表達更顯著。

氧化-還原刺激響應型納米囊:納米囊(nanocapsules，NCs)有著獨特的物理以及膠體性質，內部含有1個或多個空腔的微球，可由1種聚合物組成，也可以由多種聚合物組成。Zhao等[11]用吸附胱冬肽酶-3(caspase 3，CP-3)的丙烯酰胺單體通過二硫鍵與N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸連接，制備外層為聚合物電解質，內核為CP-3的S-S納米囊(S-SNCs)。S-SNCs的粒徑為11.3 nm，zeta電位為(3.6±0.1)mV。在含2 mmol/L GSH的磷酸鹽緩沖液中2 h后，平均粒徑降至為5.3 nm，zeta電位變為負值，結果NCs的二硫鍵在還原環境下幾乎全部解開，透射電子顯微鏡中也未觀察到呈球形的納米囊。細胞抑制率試驗證實，載附CP-3的S-SNCs誘導了HeLa，U87MG等細胞株的凋亡。Kim等[12]通過二硫鍵連接制備了內部為空心結構、外部為厚2 nm的聚合物電解質層，平均粒徑約為70 nm的納米囊，經體外釋放試驗結果證明，在100 mmol/L的DTT溶液中，納米囊迅速的釋放羧基熒光標記物。

氧化-還原刺激響應型水凝膠:納米水凝膠(nanogels)具有可調節的粒徑、三維的結構、良好的力學性能、高水溶性和生物相容性等特點，在生物工程、藥物制劑和生物材料科學中廣泛應用，可作為抗癌藥物、蛋白質、質粒DNA等的載體。新型巰基化修飾的透明質酸(hyaluronic acid，HA)納米水凝膠包覆 siRNA[13]，與HCT-116細胞中表面的特異性CD44受體結合后，可迅速被細胞攝取。電泳檢測游離siRNA在模擬人體血液環境下，4 h后迅速降解，而siRNA/HA納米水凝膠中，siRNA在24 h后都很穩定。此外，Matyjaszewski及其團隊[14]研究了具有用原子轉移自由基聚合(ATRP)還原性敏感功能基團修飾的水凝膠，這些水凝膠可以載附各種水溶性的生物大分子如抗腫瘤藥、蛋白質等。包覆DOX的納米水凝膠，載藥率約為50% ～70%，且不具有毒性。當Hela細胞中的GSH達到20wt%時，Hela細胞的增殖被抑制。Groll等[15]利用巰基修飾的超支化聚縮水甘油和聚環氧乙烷聚環氧丙烷單丁基醚制備出還原敏感型水凝膠，且通過L929細胞的MTT試驗表明，這種水凝膠具有良好的生物相容性。這些納米凝膠在10 mmol/L濃度的GSH溶液中迅速降解。

氧化-還原刺激響應型納米膠束:納米膠束(nanomicelles)由兩親性嵌段共聚物組成，具有表面親水、內部疏水的獨特殼核結構，具有溶解度高、載藥量高、毒性低的特性。納米膠束具有的小尺寸效應，可以避免過快地被網狀內皮系統(RES)攝取和經腎臟代謝，延長了膠束在血液循環的時間，使其容易被動靶向聚集在腫瘤組織。Wen等[16]制備氨基化修飾的聚乙二醇(mPEG)和聚芐氧羰基賴氨酸(polyε-benzyloxycarbonyl-L-lysine，PzLL)通過二硫鍵連接形成新型納米膠束-mPEG-SS-PzLL，并載附抗腫瘤藥物DOX。在MCF-7乳腺癌細胞的細胞攝取率試驗中，將FITC熒光標記的DOX納米膠束與MCF-7乳腺癌細胞在10 mmol/L GSH組共培養4 h后，其熒光強度是0 mmol/L GSH組的1.68倍，二者的差異具有統計學意義，證實mPEG-SS-PzLL納米膠束具有谷胱甘肽響應性。

樹枝狀高分子:樹枝狀高分子材料(dendrimers)由聚合物高度接枝組成，具有高度支化、單分散性、高對稱性的特點[17]。Harth及其研究小組[18]研究制備了載附多肽的樹枝狀高分子材料，粒徑大小約為 5～10 nm。Kurtoglu[19]用聚酰胺(poly a-midoamine，PAMAM)樹枝狀高分子材料作為藥物和基因傳遞的載體，提高了腫瘤組織的EPR效應。N-乙酰基半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)通過二硫鍵與PAMAM樹枝狀高分子材料連接后，能提高藥物療效、減少用藥劑量、避免藥物與血漿蛋白結合。在模擬血循環GSH濃度的體外釋放試驗中，NAC的體外累積釋放率幾乎為零;在模擬細胞內GSH濃度下，NAC的體外累積釋放率約為66%。熒光標記的PAMAM-NAC在小膠質瘤細胞攝取試驗中，材料與細胞共培養2 h后，熒光強度增加了兩倍。將載體與配體結合后，可以很好地靶向釋放藥物到特定細胞內。

2)pH敏感型納米載體

感染組織、原發腫瘤和繼發腫瘤組織的pH都比正常組織低。這是由于腫瘤組織迅速的增殖，腫瘤的脈管系統經常不能充分的供給營養物質和氧氣給大量的腫瘤細胞。不充分的供養使得腫瘤組織缺氧，產生乳酸和ATP水解，產生一個酸性的微環境，使得腫瘤組織的pH低于正常組織[20]。許多實體瘤組織比周圍正常組織的pH要低。根據此性質，可設計pH敏感型的刺激響應型藥物或者基因靶向傳輸系統。pH敏感型β-聚氨基酯(poly betaamino ester，PbAE)是新型生物可降解的陽離子型聚合物的一種，可作為特異性藥物和基因傳遞系統。在腫瘤組織酸性的微環境中，PbAE迅速解體并釋放載附物。以PbAE納米粒作為藥物載體，腫瘤組織的紫杉醇量明顯高于用非pH敏感型聚己丙酰胺納米粒載體的是[21]，有效提高了紫杉醇的治療效果。

3)溫度敏感型納米載體

在過去的20年中，隨著熱生物學及溫度檢測器技術的發展，在治療實體腫瘤的化學療法或放射性療法中，利用腫瘤組織局部溫度過高的治療思路越來越受到關注。腫瘤細胞比正常細胞對熱損傷更為敏感。Han等[22]用聚異丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺單體(poly N-isopropylacrylamide-co-acrylamide，PNIPAM-AAM)和聚乙二醇對脂質體的表面進行修飾，在聚合物的相變溫度下，提高了PNIPAAm-AAM/PEG修飾的脂質體釋放DOX的量。此外，研究表明，修飾后的脂質體在血液循環中比未修飾的脂質體更穩定。

4)其他刺激響應型納米載體

磁場響應性納米載體，尤其是磁敏感水凝膠能夠在外磁場環境產生變化時通過折疊、膨脹或收縮等方式對外界刺激產生響應，因而在生物相關領域具有很大的應用前景[23]。近年來，超聲在靶向給藥系統中的應用越來越受到一些學者的關注。注射含有藥物的膠束后，通過聲裂釋放藥物，這種技術可以使膠束均勻分布在腫瘤組織中[24]。光敏型納米載體也是近年來研究的熱點，特定波長的可見光可使膠束解體而釋放藥物[25]。

3 展望

以智能納米載體為基礎，設計載附抗癌藥物、抗氧化劑、多肽、蛋白質和核酸等的靶向釋放系統，可提高治療效果、避免耐藥性、減少不良反應。但現有的研究中還有許多問題有待解決，納米載體進入細胞的方式尚未明確，有報道指出是通過溶酶體和內涵體介導的胞吞的途徑進入細胞，但這種說法存在爭議，未達成一致意見;現有的研究未對智能納米載體在體內的穩定性和降解方式做出明確解釋;許多學者報道的不是在臨床范圍內可應用的可生物降解或生物相容性材料。值得關注的是，最近關于星形聚合物、阿拉伯糖醇的可降解衍生物聚氨基甲酸酯和線性可降解的聚合物等相關報道，為納米載體修飾提供了更多的選擇。我們深信，設計合理的智能納米載體，最終將被廣泛地應用于人類重大疾病的預防、診斷和靶向治療。

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