清肝祛濁劑對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠治療作用的實(shí)驗(yàn)研究*

郝亮 孫紅勝趙恒立

（山東省運(yùn)動員康復(fù)中心，山東濟(jì)南250002）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種病因不明的自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為慢性、對稱性、進(jìn)行性多關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥，增生形成血管翳，侵犯關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱，造成關(guān)節(jié)軟骨、骨和關(guān)節(jié)囊的破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。本實(shí)驗(yàn)通過對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的研究，測定其血清IL-1、TNF-α及MMP-2、MMP-9水平，觀察清肝祛濁中藥高、中、低濃度治療膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的免疫作用，探討其抗炎作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物7周齡Wistar大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量（150±30）g，由山東省立醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 藥物與試劑清肝祛濁中藥，組方：夏枯草20 g，片姜黃12 g，薏苡仁30 g，土茯苓30 g，虎杖20 g，土貝母10 g（購自山東省中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院）。藥材煎液濃縮到每1mL藥液含生藥2g。甲氨蝶呤片（MTX）為齊魯制藥有限公司產(chǎn)品（批號20033063）；牛Ⅱ型膠原為美國Sigma公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑由美國Lifetechnologies提供；TNF-α試劑盒由深圳晶美公司提供（批號012602）；IL-1β試劑盒為TBD生物發(fā)展中心產(chǎn)品。

1.3 模型制備取80只Wistar大鼠，除空白組10只外，剩余70只大鼠造模。牛Ⅱ型膠原溶解于0.05 mol/L冰醋酸中，濃度為2 mg/mL，4℃過夜，逐滴加入等體積的完全弗氏佐劑中。第1日每只大鼠接受0.5 mL乳劑，分5點(diǎn)等量注射于兩后足足墊處，尾部處，頸背部真皮內(nèi)。免疫7 d后動物接受相同的加強(qiáng)注射，第20日用體積描記法測量每只大鼠兩只后腳掌的體積，選用腳掌體積≥1.8 mL的動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 分組與給藥選擇符合實(shí)驗(yàn)要求的大鼠50只，隨機(jī)分為5組。單純模型組灌胃生理鹽水組3.8 mL/kg；甲氨蝶呤片組灌胃甲氨蝶呤750 μg/kg；中藥低劑量組灌胃清肝祛濁中藥3.8 g/kg；中藥中劑量組灌胃清肝祛濁中藥7.6 g/kg；中藥高劑量組灌胃清肝祛濁中藥15.2g/kg；每日1次，連用28d。第28日大鼠股動脈取血，靜置30min后2500r/min離心15min，取上清液，冷藏待測。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

1.5.1 足腫脹率以右后足為觀察對象，從用藥后第10日開始每日記錄各組動物右后足的發(fā)病率，并于第14、28日記錄右后足體積，腫脹率=給藥后足趾體積/給藥前體積×100%。

1.5.2 關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)外病變觀察及關(guān)節(jié)炎評分各關(guān)節(jié)病變程度按5級評分法：0分為無紅腫；1分為關(guān)節(jié)紅不腫；2分為關(guān)節(jié)輕度紅腫；3分為關(guān)節(jié)中度紅腫；4分為關(guān)節(jié)重度紅腫伴功能障礙。關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)（AS）為每只小鼠所有病變關(guān)節(jié)分?jǐn)?shù)的總和，最高分為16分。各劑量組所有小鼠關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)之總和除以該組小鼠的只數(shù)，即為該組平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)（MAI）。

1.5.3 細(xì)胞因子的測定IL-1β和TNF-α的測定采用ELISA試劑盒。

1.5.4 MMP-2、MMP-9的測定靜脈血，-20℃保存，用雙抗體夾心ELISA法測定MMP-2、MMP-9。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。結(jié)果 以（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)的比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠右后足體積腫脹率及平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化結(jié)果 表明，與模型組比較，第14日甲氨蝶呤組右后足體積腫脹率有所下降（P＜0.05），中藥低劑量組無明顯差異，中劑量組和高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。第28日甲氨蝶呤組，低、中、高劑量組右后足體積腫脹率均顯著下降（P＜0.01）。第14日甲氨喋呤組、低劑量組平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)有所下降（P＜0.05）；中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。第28日各組平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯下降（P＜0.01）。

表1 各組大鼠右后足體積腫脹率及平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠右后足體積腫脹率及平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較（±s）

與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別n右后足體積腫脹率（%）平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)14 d28 d14 d28 d空白組模型組1082.2±2.681.7±2.18.4±0.68.2±0.4甲氨蝶呤組1079.3±2.4△58.9±1.9△△7.8±0.4△4.9±0.2△△中藥低劑量組1081.2±1.864.8±2.1△△7.9±0.2△6.2±0.3△△中藥中劑量組1073.1±2.7△△49.7±2.4△△7.6±0.5△△4.4±0.2△△中藥高劑量組1062.2±2.2△△41.8±1.9△△7.6±0.3△△3.9±0.5△△

2.2 各組大鼠血清IL-1β和TNF-α的變化見表2。結(jié)果 表明，甲氨蝶呤組、中藥中劑量組、高劑量組可以明顯降低IL-1β水平（P＜0.01）；中藥低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。甲氨蝶呤組能夠降低TNF-α水平（P＜0.05）；低劑量組對TNF-α水平無影響；中、高劑量組可以明顯降低TNF-α水平（P＜0.01）。

表2 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較（±s）

表2 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較（±s）

IL-1β（pg/mg）TNF-α（pg/mL）空白組105.47±1.06△37.26±8.97△△模型組108.66±1.3462.54±11.73甲氨蝶呤組106.42±1.45△49.78±12.65△中藥低劑量組107.61±1.2155.11±9.67中藥中劑量組106.25±1.36△46.89±10.44△△中藥高劑量組106.12±1.44△42.66±11.47△△組別n

2.3 CIA大鼠血清MMP-2和MMP-9的變化見表3。結(jié)果 表明，甲氨蝶呤組，中藥低、中、高劑量組均可以明顯降低MMP-2、MMP-9的水平（P＜0.05）。

3 討論

目前類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中，炎性細(xì)胞因子異常活躍已得到公認(rèn)，特別是血清白介素和TNF-α水平顯著升高與RA密切相關(guān)。同時研究證明，細(xì)胞外基質(zhì)是維持骨組織結(jié)構(gòu)完整的重要成分。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）對ECM的降解是RA患者關(guān)節(jié)破壞的必要環(huán)節(jié)［1-2］。MMP-2、MMP-9是明膠酶，是水解細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞的關(guān)鍵酶［3］，可以降解ECM中的Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅶ型及Ⅺ型膠原和纖維結(jié)合素、層粘連蛋白及蛋白多糖，而這些成分也是關(guān)節(jié)軟骨的重要組成成分。所以二者在RA發(fā)病中可能起著重要作用，但這方面的研究較少。近年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)RA患者的滑液及外周血中MMP-2、MMP-9水平均增高［4-5］。筆者的測定表明，CIA大鼠血清中MMP-2、MMP-9水平顯著高于空白組。Uchibori等［6］對關(guān)節(jié)炎模型小鼠研究也證明MMP-2、MMP-9在關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起一定作用。

筆者根據(jù)中醫(yī)學(xué)對本病的認(rèn)識，結(jié)合近年來對本病的大量臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為肝主筋，筋束骨，連絡(luò)關(guān)節(jié)，外感濕熱之邪，郁于肝筋，氣機(jī)不暢，濕熱之邪乘虛而入，造成經(jīng)絡(luò)痹阻；或肝失疏泄，影響脾胃升降，運(yùn)化失常，濕濁內(nèi)生，濕郁化熱，濕熱相搏而傷筋骨，產(chǎn)生筋肌病變，進(jìn)而提出肝經(jīng)濁毒，脾濕蘊(yùn)結(jié)的病機(jī)觀點(diǎn)，選用清肝健脾利濕祛濁中藥（夏枯草、片姜黃、薏苡仁、土茯苓、虎杖、土貝母）進(jìn)行治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究。通過對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的觀察測定其血清白介素及MMP-2、MMP-9水平，發(fā)現(xiàn)高、中劑量的中藥可以明顯減輕膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腫脹狀態(tài)，并明顯降低白介素及MMP的水平，具有良好的抗炎作用。該中藥配伍可能是通過抑制炎性細(xì)胞因子及MMPs的產(chǎn)生，從而抑制其對軟骨和骨質(zhì)的破壞，對中醫(yī)治療RA有很高的借鑒意義。

表3 各組大鼠血清MMP-2和MMP-9水平比較（μmol/L，s）

表3 各組大鼠血清MMP-2和MMP-9水平比較（μmol/L，s）

MMP-2MMP-9空白組100.37±0.04△0.26±0.05△△模型組100.89±0.020.92±0.05甲氨蝶呤組100.58±0.05△0.54±0.02△△中藥低劑量組100.64±0.04△0.68±0.04△△中藥中劑量組100.55±0.04△0.51±0.03△△中藥高劑量組100.47±0.03△0.42±0.03△△組別n

［1］ Yoshihara YH，Nakamura K，Obata H，et al.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in synovial fluids from patients with rheumatoid arthritis or osteoarthritis［J］.Ann Rheum Dis，2000，59：455-459.

［2］ Gaye C，Oliver FG，Charlotte B，et al.Early joint erosions and serum levels of matrix metalloproteinases 1，matrix metalloproteinase 3，and tissue inhibitor of metalloproteinases 1 in rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2001，44（10）：2263-2274.

［3］ matrisian LM.Metallop roteinase and their inhibitors in tissue remodeling［J］.Trends Genetics，1990，6：12.

［4］ Yamanaka HK，Makino M，Takizawa H，et al.Expression and tissue localization of membrane-types 1，2，and 3 matrix metalloproteinases in rheumatoid synovium［J］.Lab Invest，2000，80：677-680.

［5］ Giannelli G，Erriquez R，Iannone F，et al.MMP-2，MMP-9，TIMP-1 and TIMP-2 levels in patients with rheumatoid arthritis and psoriatic arthritis［J］.Clin Exp Rheumatol，2004，22（3）：335-338.

［6］ Uchibori M，Nishida Y，Tabata I，et al.Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in pigmented villonodular synovitis suggests their potential role for joint destruction［J］.J Rheumatol，2004，31（1）：110-119.