丹參注射液對兔視網膜缺血再灌注損傷后視網膜節細胞凋亡和caspase-3表達的影響

張鐵華張永利張春麗劉林英楊濤

（1.河北省玉田縣醫院，河北玉田064100；2.河北省唐山市協和醫院，河北唐山063000）

視網膜缺血再灌注損傷是多因素綜合作用的結果 ，主要包括氧自由基的損傷作用，細胞內的鈣超載現象，白細胞作用以及細胞凋亡等。動物實驗表明，丹參對視網膜缺血再灌注損傷有保護作用，本實驗通過建立兔視網膜缺血再灌注損傷模型，觀察應用丹參注射液后，對兔視網膜神經節細胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表達的影響，進一步證實丹參注射液對視網膜缺血再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物48只健康純種大耳白兔，購于北京實驗動物中心，體質量（3.0±0.2）kg，雄性，外眼及眼底檢查均正常，室溫環境飼養。

1.2 試藥與儀器OLYMPUS光學顯微鏡（日本Olympus公司）Hplas-1000彩色病理圖文分析系統（同濟千屏影像工程公司）丹參注射液（四川三精升和制藥有限公司10 mL/支），細胞凋亡檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），SABC試劑盒（即用型，武漢博士德生物工程有限公司），Caspase-3免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 分組與給藥隨機分為對照組與治療組，以20%烏拉坦5 mL/kg耳緣靜脈注射麻醉，同時兔眼滴用0.4%倍諾喜（奧布卡因）行表面麻醉，對照組球后注射平衡鹽溶液0.05 mL（48只，左眼），治療組球后注射丹參注射液0.05 mL（48只，右眼）。

1.4 模型制備給藥30min后開始建立模型，復方托品酰胺滴眼液散瞳后將連接生理鹽水的5號頭皮針從耳前方角鞏膜緣內刺入前房，緩慢升高輸液瓶高度產生16.7kPa壓力，觀察并監測眼睛情況。60min后將輸液瓶高度逐漸降低，緩慢減低眼內壓，直至輸液瓶高度到動物眼球水平，拔除灌注針頭，視網膜血供恢復。

1.5 標本采集與檢測根據各組不同的再灌注時間，分別于損傷后1、6、24和72 h全身麻醉后，耳緣靜脈快速注入空氣栓塞處死，取出眼球，至于冰生理鹽水中，剪開角鞏膜緣，棄去眼前節及玻璃體，外翻眼球壁，在顯微鏡下剝離視網膜，分析天平稱重，用生理鹽水稀釋，勻漿，低溫離心機3500 r/min離心10 min，取上清液，置于4%多聚甲醛固定24 h，然后小心去除角膜、虹膜、晶狀體及玻璃體，將后段眼環再固定4 h。流動自來水沖洗24 h，之后于75%酒精（60 min）→85%酒精（60 min）→95%酒精（60 min）→95%酒精（60 min）→無水酒精Ⅰ（60 min）→無水酒精Ⅱ（40 min）→二甲苯Ⅰ（15 min）→二甲苯Ⅱ（10 min）→將眼球壁自視乳頭處縱向切開，距角鞏膜緣0.2 mm向鼻側和顳側各取1 cm×0.5 cm的視網膜組織，將視網膜組織分別置于68℃恒溫箱浸蠟（2 h），石蠟包埋。行前后方向視網膜全層切片，片厚2.5 μm。切片分采用TUNEL（即脫氧核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法）染色計數凋亡陽性細胞及計數Caspase-3的蛋白表達陽性細胞。

1.5.1 視網膜節細胞凋亡的檢測每只眼球取兩張切片進行分析，用圖像分析計數系統對凋亡神經節細胞切片進行圖像分析。在圖像分析儀上對待測樣本取樣，在視網膜切片中央部位向兩側各取兩個連續不重疊的高倍視野（HP），分別計數陽性細胞數，4者相加的結果 作為每mm2的平均TUNEL陽性細胞數。

1.5.2 免疫組化檢測Caspase-3蛋白表達按試劑盒說明進行操作，細胞漿染成棕黃色為蛋白陽性表達。在視網膜切片中央部位向兩側各取兩個連續不重疊的高倍視野（HP），計數每個視野陽性細胞數，算出平均數即為每張切片陽性細胞數。

1.6 統計學處理應用SPSS13.0統計軟件。數據以（±s）表示，兩組樣本均數差別的t檢驗，方差分析同一組內不同時間點數據的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丹參注射液對視網膜節細胞凋亡的影響見表1。除1 h外，同一時間點對照組與治療組差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 丹參注射液Caspase-3的蛋白表達的影響見表2。除1h外，同一時間點對照組與治療組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

視網膜缺血再灌注損傷是眼科臨床常見的一種病理過程，如視網膜中央動脈栓塞、缺血性視神經病變、青光眼等在這個過程中，細胞凋亡發揮著重要的作用。有研究表明，RIR是通過誘發細胞凋亡引起神經元死亡所致，最終的結局均是RGC的凋亡［1］。

近年來發現，凋亡是RIRI后神經節細胞死亡的形式之一［2］。凌士奇等［3］通過實驗證實RIR中視網膜內層細胞存在著明顯的凋亡征象，尤以RIRI 24 h組最為顯著。凋亡細胞的出現遵循其規律，張瑞等［4］通過對大鼠視網膜缺血再灌注損傷模型中缺血再灌注視網膜超微結構觀察，發現再灌注24 h視網膜神經節細胞數量明顯減少，可見凋亡小體。李國棟等［5］應用TUNEL的方法 ，研究發現，正常大鼠視網膜TUNEL染色陰性。Kaneda［6］通過實驗發現凋亡最早出現在視網膜缺血再灌注損傷后6 h，24 h凋亡細胞的數量達到高峰，48 h開始下降，168 h凋亡細胞數目已經極少，而在正常視網膜幾乎未見神經節細胞的凋亡。筆者應用TUNEL方法 進行凋亡細胞的檢測，研究發現：正常兔視網膜TUNEL染色陰性，本實驗結果 也證實了上述觀點。本實驗結果 為：在缺血再灌注損傷過程中發生了細胞凋亡，凋亡細胞主要分布在神經節細胞層，最早出現在再灌注后1 h，6 h后視網膜細胞凋亡數量增加，24 h細胞凋亡數量達到了高峰，并在外核層偶爾可見凋亡細胞，到了再灌注后72 h，仍然有凋亡細胞，說明了再灌注后72 h，視網膜的損傷尚未完全修復，與Ettaiche等［7］的研究結果 相近。

天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白激酶家族（caspases）是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶，凋亡的最后實施是通過caspases的激活而實現的。Caspases的激活表現為“瀑布式”的級聯反應，而caspase-3是caspases級聯反應中下行的最關鍵的凋亡執行蛋白酶，在各種程序啟動的凋亡程序中起最后樞紐的作用［8］。caspase-3作為細胞凋亡的關鍵性蛋白酶，直接導致凋亡細胞解體，酶解細胞結構蛋白，切斷凋亡細胞與周圍細胞的聯系，關閉DNA的復制與修復，降解DNA，最后將細胞解體并包裹形成凋亡小體［9］。caspase-3（cpp32）處于被認為是蛋白級聯切割過程的凋亡核心位置，起著很重要的作用，稱為死亡蛋白酶［10］。本研究發現caspase-3在視網膜缺血再灌注損傷中表達明顯增多，進一步證實此過程中細胞凋亡的存在，而治療組中，caspase-3表達明顯減弱。由上可以看出，丹參注射液能夠抑制caspase-3表達，并進而抑制不同因素誘導的神經節細胞凋亡，從本實驗中可以得出，丹參注射液在視網膜缺血再灌注損傷中通過抑制caspase-3的表達而達到抑制凋亡的目的 。

本實驗應用球后注射丹參注射液治療兔視網膜缺血再灌注損傷，觀察其對視網膜節細胞凋亡、caspase-3蛋白表達的影響，結果 顯示：除1h外，治療組各時間點凋亡細胞數量、caspase-3蛋白表達均較對照組明顯減少。從本實驗中可以得出：丹參注射液可以通過抑制細胞凋亡、抑制caspase-3表達和活化而起到對視網膜缺血再灌注損傷的保護與治療作用。

表1 兩組凋亡陽性細胞數比較（個／mm2，±s）

表1 兩組凋亡陽性細胞數比較（個／mm2，±s）

與對照組同一時間比較，*P＜0.05。下同

組別再灌注24 h再灌注72 h治療組11.55±0.24*5.39±0.26*對照組18.56±0.277.00±0.21再灌注1 h再灌注6 h 1.10±0.116.58±0.27*1.16±0.1310.31±0.22 n 12 12

表2 兩組視網膜缺血再灌注后不同時段Caspase-3表達比較（細胞數/mm2，±s）

表2 兩組視網膜缺血再灌注后不同時段Caspase-3表達比較（細胞數/mm2，±s）

組別再灌注24 h再灌注72 h治療組8.25±0.15*5.23±0.26*對照組14.19±0.216.72±0.23 n 12 12再灌注1 h再灌注6 h 1.12±0.135.52±0.14*1.15±0.158.32±0.16

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