宮內感染HBV嬰兒免疫失敗與IL-2、IFN-γ表達的相關性研究①

梅 燕 廖 滔 鄧新瓊 唐 玲 蔡 稔 (廣西柳州市婦幼保健院婦產科，柳州545001)

乙型肝炎疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白聯合阻斷乙型肝炎病毒母嬰傳播的作用已十分肯定，但近年來仍有10%～20%的母嬰傳播阻斷失敗。乙肝病毒宮內感染是新生兒出生后乙肝疫苗接種失敗的主要原因。如何降低宮內感染HBV免疫失敗率是目前國內外專家致力的方向，其中細胞因子調控網絡與宮內感染HBV接種乙肝疫苗失敗的關系是他們研究的熱點話題。白介素2(Interleukin-2，IL-2)是1976年Morgan等人用植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(Con A)等刺激T淋巴細胞產生的一種因子，它主要是由 CD4+細胞產生，能直接刺激T細胞增殖，激活T細胞、B細胞和NK細胞等多種免疫細胞，并且能誘導產生γ-干擾素，誘導多種細胞因子的產生、細胞因子受體表達和產生新型的殺傷細胞(LAK細胞)［1］，對HBV的免疫清除有賴于正常的IL-2產生和IL-2R的表達，IL-2分泌異常時，細胞免疫功能發生障礙［2］。本研究探討宮內感染HBV嬰兒免疫失敗與外周血單核細胞不同刺激下細胞因子IL-2、IFN-γ水平的相關性，從而探討免疫失敗的原因及可能有效的預防措施，為降低免疫失敗和慢性HBV攜帶狀態的發生提供理論依據。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象及分組 選擇2007年7月至2008年7月廣西柳州市婦幼保健院產科住院無癥狀的乙肝表面抗原(HBsAg)陽性孕婦分娩的新生兒50例，其在出生后立即肌內注射200 U乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)，并于出生時、1個月、6個月分別注射酵母重組乙型肝炎疫苗，每次10 μg，出生后7個月時進行隨訪抽取靜脈血檢測HBV血清學標志物及HBV-DNA。20例HBV血清學標志物均為陰性的孕婦分娩的嬰兒作為正常對照組。研究組病例孕期均符合以下標準：(1)血清 HBsAg和(或)HBeAg陽性，孕婦自孕28周起肌內注射 HBIG，分別于28、32、36周各肌注200 U HBIG;(2)血清甲、丙、丁、戊、庚等肝炎系列檢查呈陰性;(3)孕期未使用其他研究藥物、抗病毒藥物、細胞毒性藥物或皮質類固醇激素類藥物;(4)無其他產科并發癥及合并癥(如胎膜早破、先兆早產、先兆流產、妊娠高血壓等);(5)肝、腎功能正常;(6)孕期無明顯感染性疾病(如陰道炎及TORCH感染、艾滋病、梅毒等);(7)B超排除胎兒畸形。所有病例均排除父親有乙肝病史。總共70例孕婦共分娩70例新生兒。HBsAg陽性孕婦分娩的嬰兒和正常對照組新生兒出生時的體重、Apgar評分、性別及分娩時胎齡、分娩方式比較，均無明顯差異。

1.1.2標本采集及處理 在嬰兒家屬知情同意下，出生7個月時，抽取70例嬰兒靜脈血2 ml裝肝素抗凝管留作試驗用，50例研究組嬰兒多抽取3 ml做乙肝標志物檢測及HBV-DNA定量。

1.1.3主要耗材與儀器 耗材：Hank＇s液、淋巴細胞分離液、10%小牛血清的RPMI1640、0.2%臺盼蘭染液、計數板、植物血凝素、酵母重組 HBsAg、IFN-γ和IL-2 ELISA試劑盒。儀器：4℃低溫離心機、倒置顯微鏡、自動酶聯檢測儀。

1.2方法

1.2.1PBMC的分離、刺激和培養 常規分離PBMC，用RPMI1640完全培養液調整細胞濃度為2×106個/ml，取等量的細胞懸液與0.2%臺盼蘭染液混合，計算出活細胞百分率達95%以上。將外周血單個核細胞懸液等量分成3份置于不同的培養瓶中，分別加入PHA(終濃度為10 μg/ml)，酵母重組HBsAg(終濃度設置為 2.5 μg/ml)，RPMI1640(設為無刺激組)。置于37℃、5%CO2條件下培養48小時(h)。

1.2.2細胞因子定量 采用ELISA法。嚴格按照說明書進行培養液的上清液中IFN-γ和IL-2水平檢測。ELISA步驟完成以后，記錄吸光度(OD)，分別以標準品吸光度為縱坐標、標準品濃度為橫坐標描繪標準曲線，然后，在標準曲線上根據樣品的吸光度找到相對應的樣品的濃度。

1.3統計學處理 采用SPSS軟件進行統計。計量資料采用中位數(M)描述，不同組間的比較采用秩和檢驗(Kruskal-Wallis H法)，兩兩比較采用擴展t檢驗法。統計學檢驗水準為0.05，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1上清液IFN-γ水平的比較 采用ELISA法檢測細胞培養上清液中IFN-γ、IL-2水平，非特異性刺激源(絲裂原)刺激誘導免疫反應時三組IFN-γ、IL-2分泌均增加，但3組比較無顯著性差異(P=0.058;P=0.408)。在無刺激誘導時，免疫失敗組較免疫有效組和正常對照組IL-2、IFN-γ的分泌低下。在酵母重組HBsAg 2.5 μg/ml刺激下，3組IL-2、IFN-γ分泌均有增加，3組比較均有顯著性差異(P＜0.01;P＜0.01)。免疫失敗組增加最明顯，免疫失敗組和對照組差異有非常顯著性差異(P＜0.01;P＜0.01)。見表1。

表1 嬰兒PBMC培養液的上清液IFN-γ、IL-2水平的比較(μg/ml)Tab．1 Levels of IFN-γ，IL-2 in newbaby PBMC culture suspension clear liquid(μg/ml)

2.2IL-2和IFN-γ的關系 在HBsAg刺激時IL-2和IFN-γ分泌呈正相關(r=0.335，P=0.005)。

3 討論

乙型肝炎疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白聯合阻斷是降低HBV母嬰傳播的一項非常有效的措施，但近年來文獻報道仍有10%～20%的發生免疫失敗，宮內感染是其主要原因。袁榮等［3］研究認為宮內感染HBV并侵犯PBMC，使其IL-2分泌能力下降，可能是導致新生兒免疫接種失敗的機制之一。

本課題采用體外細胞培養和ELISA技術對18例宮內感染HBV免疫失敗嬰兒、32例宮內感染有效嬰兒及20名正常嬰兒外周血單個核細胞分別在絲裂原(植物血凝素)、酵母重組HBsAg刺激時γ-干擾素(IFN-γ)、白細胞介素2的分泌進行檢測。發現非特異性刺激源(絲裂原)刺激誘導免疫反應時3組IL-2、IFN-γ分泌均有增加，但3組比較無顯著性差異，說明對非特異性刺激源均存在細胞免疫反應，且不產生免疫耐受。在酵母重組HBsAg刺激誘導時，免疫失敗組較免疫有效組和正常對照組IL-2、IFN-γ的分泌低下。在酵母重組 HBsAg 2.5 μg/ml刺激下，3組IL-2、IFN-γ分泌均有增加，3組比較均有顯著性差異(P＜0.01;P＜0.01)。免疫失敗組增加最明顯，免疫失敗組和對照組差異有非常顯著性差異(P＜0.01;P＜0.01)。在HBsAg刺激時 IL-2和IFN-γ分泌呈正相關(r=0.335，P=0.005)。

宮內感染免疫失敗的兒童外周血單個核細胞(PBMC)對乙型肝炎表面抗原(HBsAg)特異性增殖反應低下，IL-2產生和 IL-2受體表達不足，機體處于免疫耐受狀態［4，5］。有研究認為新生兒在T細胞水平對HBV抗原的耐受程度與抗-HBs的產生滴度相關，這表明HBV宮內感染新生兒的免疫耐受大多是不完全的，通過使用細胞因子、免疫佐劑等方法部分可以消除或逆轉，當耐受狀態逐漸消除或逆轉后方可產生免疫應答。HBsAg是一種胸腺依賴性抗原，它誘導機體產生抗-HBs必須經過抗原的提呈、輔助性T淋巴細胞的識別和B淋巴細胞的激活與分化，另外還需要多種免疫細胞與分子的共同參與。在這個復雜過程中任一步驟出現問題，都可導致機體對乙肝疫苗應答水平低下或無應答。根據近年來的研究，乙肝免疫球蛋白是通過增加Th1型細胞的活化，促進體內干擾素-γ、白細胞介素12的分泌達到清除新生兒體內 HBV的目的，并降低其體內HBV-DNA含量，從而有效降低新生兒HBV感染率。乙肝疫苗能誘發持久的特異性細胞及體液免疫應答。二者結合能夠阻斷80%～90%的HBV母嬰傳播。IL-2、IFN-γ均為Th1型細胞產生。IL-2重要的作用是能夠誘導T淋巴細胞增殖和分化。T細胞受多種刺激后可分泌IL-2，誘導細胞分泌細胞因子(IFN-γ、IL-4、TNF 和 CSF 等)，同時，IL-2 還能作用于T細胞本身，誘導自身增殖、分化和發揮功能。IFN-γ是 NK細胞和 T細胞(包括 CD4+Th1和CD8+T細胞)都能產生，可作為抗原提呈細胞和T淋巴細胞的增殖、分化的調節因子，參與細胞炎癥反應和抗病毒［6，7］。朱啟镕等認為高表達量的 IFN-γ對病毒清除有重要作用。宮內HBV感染兒童外周血單個核細胞在HBsAg特異性刺激時IFN-γ分泌水平低于正常免疫兒童。說明HBV宮內感染與IFN-γ分泌水平不足有關。很多研究也證實了這一點。綜上所述，IL-2與IFN-γ是一種誘導與被誘導的關系，同時IL-2還能誘導其自身增殖，有將免疫反應級聯放大的效應，從本實驗的結果來看，IL-2的表達與IFN-γ的分泌關系密切，所以我們推測增強免疫細胞產生IL-2的水平，可以促進IFN-γ的表達，從而打破細胞的免疫耐受，產生免疫應答。

本研究提示IL-2分泌能力低下，誘導IFN-γ產生的能力低下，可能是宮內感染導致乙肝疫苗失敗的機制。因此外源性加入IL-2，加強特異性免疫反應，誘導免疫細胞產生足夠的IFN-γ，或可消除或逆轉免疫耐受，從而達到更有效的免疫應答，但是本實驗的結果還需要大樣本的研究驗證，且這種免疫治療的安全性和有效性還需要進一步深入的研究。

1 陳慰峰.醫學免疫學［M］.第3版.北京：人民衛生出版社，2000：45-48.

2 Guidotti L G，Rochford R，Chung J et al．viral clearance without destruction of infected cells，during acute HBV infection ［J］.Science，1999;284(5415)：825-829.

3 袁 榮，王晨虹，劉曉梅 et al．HBV母嬰傳播致新生兒免疫失敗的原因和機制［J］.第四軍醫大學學報，2005;26(7)：647-649.

4 俞 蕙，朱啟镕，呂 晴et al．宮內HBV感染接種乙型肝炎疫苗小兒的細胞免疫功能研究［J］.中華傳染病雜志，1997;15(1)：76-78.

5 朱啟镕，于廣軍，呂 晴 et al．宮內感染乙型肝炎病毒兒童接種乙型肝炎疫苗免疫失敗與其相關細胞因子關系研究［J］.中華兒科雜志，1999;37(7)：404-407.

6 王建設，朱啟镕.宮內感染乙型肝炎病毒免疫失敗兒童Ⅰ型和Ⅰ型細胞因子研究［J］.中華兒科雜志，2002;40(8)：481-484.

7 Guidotti L G，Chisari F V.Cytokine-mediated control of viral infections［J］.Virology，2002;273：221-227.