沙丁胺醇氣霧劑微生物限度檢查的方法建立和驗證

霍天鳳

(河南省焦作市食品藥品檢驗所 河南焦作 454000)

微生物限度檢查是檢查非規定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法,檢查項目包括細菌數、霉菌數、酵母菌數以及控制菌檢查[1]。是對生產單位是否按GMP規范生產的驗證。在實際檢驗工作中,由于某些藥品成分具有抗菌活性,抑制了藥品中微生物的生長,按常規法檢驗不能真實地反映藥品中污染微生物的情況,必須先消除供試品中的抑菌活性,再根據中國藥典規定的方法進行檢查[2～4],同時,必須對所采用的檢測方法進行驗證,以確認其抑菌活性的消除和檢查方法的有效性和可靠性。

沙丁胺醇為選擇性較強的β2受體激動劑,吸入時對心臟的興奮作用比異丙腎上腺素小,沙丁胺醇擴張支氣管作用,第一秒鐘最大呼吸量和心率增加作用隨劑量平行上升,其擴張支氣管作用約為心率作用的8倍。沙丁胺醇氣霧劑中含有乙醇,具有抑菌作用,顯然不能用常規的微生物限度檢查方法,本文采用薄膜過濾法,并進行方法驗證,結果薄膜過濾法用于沙丁胺醇氣霧劑的微生物限度檢查科學、準確。

1 儀器與材料

1.1 儀器

GHP-9162型電熱恒溫培養箱(慧科電子);SPX-150型生化培養恒溫箱(慧科電子);LMQ.C-3260J型立式滅菌器(山東新華);凈化工作臺(蚌埠);Htysteritest601集菌儀(杭州高得);精密移液器。

1.2 材料

菌種:大腸埃希菌[CMCC(B)44 102];金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26 003];枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63 501];白色念珠菌[CMCC(F)98 001];銅綠假單胞菌[CMCC(B)10 104](以上菌種均從河南省食品藥品檢驗所購買)。

營養瓊脂培養基;營養肉湯培養基;改良馬丁培養基;玫瑰紅鈉瓊脂培養基;膽鹽乳糖增菌培養基;溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基;甘露醇高鹽瓊脂培養基;MUG試劑;pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(以上培養基均由中國藥品生物制品檢定所監制);靛基質試液;氯化鈉。

樣品:沙丁胺醇氣霧劑(批號分別為1104004,1107024,1106005)。

表1 回收率測定結果

2 細菌、霉菌及酵母菌計數

2.1 供試液對照組試驗

取樣品冷凍1h,消毒開啟部位,無菌鋼錐鉆孔,放至室溫,待拋射劑全部釋出,用無菌注射器吸出藥液,用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成1:10供試液。

取供試液1mL注入100mLpH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液,搖勻,以無菌操作用裝有直徑50mm、孔徑為0.45um微孔濾膜的過濾器過濾,用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜,每張濾膜沖洗量100mL,制4張濾膜,取出濾膜,菌面朝上,其中2張貼于凝固的營養瓊脂培養基平板上,35℃倒置培養48h;另2張貼于凝固的玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板上,25℃倒置培養72h。培養后計數,為供試液對照組數據。

2.2 菌液組試驗

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中,35℃培養18～24h,取上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數為50～100cfu的菌懸液(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌液的稀釋倍數一般為106～107,枯草芽孢桿菌的稀釋倍數一般為104～105)。接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中,25℃培養24～48h。取上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數為50～100cfu的菌懸液(稀釋倍數一般為104～105)。

分別取以上各菌懸液1 m L注入100mLpH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液中,搖勻,以無菌操作,用裝有直徑50mm、孔徑為0.45um微孔濾膜的過濾器過濾,過濾后,取出濾膜,菌面朝上,大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的濾膜貼于凝固的營養瓊脂培養基平板上,30～35℃倒置培養48h;白色念珠菌的濾膜貼于凝固的玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板上,23～28℃倒置培養72h。培養后計數為菌液組數據。

2.3 試驗組試驗

取1∶10供試液1mL注入100mLpH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液,搖勻,以無菌操作用裝有直徑50mm、孔徑為0.45um微孔濾膜的過濾器過濾,用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜,每張濾膜沖洗量100mL,在最后一次沖洗液中加入1mL含菌數為50～100cfu的菌懸液,過濾后,取出濾膜,菌面朝上,加大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的濾膜貼于凝固的營養瓊脂培養基平板上,30～35℃倒置培養48h;加白色念珠菌的濾膜貼于凝固的玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板上,23～28℃倒置培養72h。培養后計數為試驗組數據。

2.4 回收率計算

用實驗組數據減供試品對照組數據,然后除以菌液組數據,即為試驗菌回收率。結果見表1。

以上結果表明:各菌液回收率均＞70%,符合藥典要求,說明薄膜過濾法可用于沙丁胺醇氣霧劑的細菌、霉菌及酵母菌計數。

3 控制菌檢查

3.1 方法

取2.1項1:10供試液10mL按2.3方法制備濾膜,在最后一次沖洗液中分別加大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌。加大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的濾膜分別置100mL膽鹽乳糖培養基中培養18～24h,加金黃色葡萄球菌的濾膜置100ml營養肉湯培養基中培養18～24h。

取大腸埃希菌培養液0.2mL置5mLMUG培養基管內培養,分別于5、24h時,366nm紫外光下觀察。觀察之后,加數滴靛基質試液于MUG管內,觀察。

取銅綠假單胞菌的培養液劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上,培養18～24h,觀察。

取金黃色葡萄球菌的培養液劃線接種于甘露醇高鹽瓊脂培養基平板,培養24～72h,觀察。

3.2 結果

大腸埃希菌的MUG管內培養物呈現熒光,加靛基質試液后,液面呈玫瑰紅色,為大腸埃希菌陽性。金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的平板也呈典型陽性菌落。說明此方法可以消除沙丁胺醇氣霧劑中抑菌成分的干擾,檢出試驗菌,符合藥典規定,可以用于沙丁胺醇氣霧劑的控制菌檢查。

以上試驗證明,薄膜過濾法可用于沙丁胺醇氣霧劑的微生物限度檢查,其結果準確、可靠。

4 討論

(1)微生物限度檢查是檢查生產企業是否按GMP規范生產的一種手段,是藥品標準的一個重要項目,可由于藥品成分復雜,尤其是抗生素、抗菌藥和某些中成藥,它們有特殊的抑菌作用,因此,以前的常規法檢查微生物限度就不能反映藥品的真實情況,出現假陰性,漏檢現象,導致這些藥品到人體內,溫度營養均適宜的環境下重新復蘇、繁殖生長,危害人的健康。因此,研究制定出科學、準確、可靠、規范的微生物限度檢查方法勢在必行[5～7]。

(2)沙丁胺醇氣霧劑是呼吸道用藥,必須檢查金黃色葡萄球、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌等控制菌,因此需要做這3個控制菌的方法學驗證。

(3)本文的所有試驗均需作空白試驗或空白對照試驗。

(4)濾膜應菌面朝上放在培養基平板上,這樣膜上的細菌才可以更好的在氧和養的環境下生長。

[1] 中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典(二部)[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄107～116.

[2] 鐘長鳴,陳曦,吳燕紅.微生物限度和無菌檢查方法驗證中存在的問題[J].中國藥品標準,2011(1):12～13.

[3] 陳萬里,李勇軍,王永林,等.紫金透骨噴霧劑微生物限度檢查方法學驗證研究[J].中國藥房,2010,19(43):4090～4092.

[4] 趙瑛,史琛,黃璞.碘酊微生物限度檢查方法的驗證[J].中國藥師,2011(9):1382～1383.

[5] 李佳寧,駱勇,吳娟.執行微生物限度檢查工作中存在的問題及建議[J].中國藥業,2008(8):8.

[6] 馬鳴曉.地級市藥檢所開展無菌和微生物限度檢查方法學驗證工作之我見[J].中國藥師,2008(9):1105～1106.

[7] 陶紅.中藥制劑微生物限度檢查方法研究進展[J].中國藥房,2010,19(19):1813～1815.