表達紅色熒光蛋白重組柯薩奇病毒B組3型基因組穩定性分析

趙文然，鐘學寬，張淑娟，沃曉嫚，張中海，王博，鐘照華

1. 哈爾濱醫科大學細胞生物學教研室，哈爾濱 150086； 2. 哈爾濱醫科大學地方病防治研究中心，哈爾濱 150086； 3. 哈爾濱醫科大學微生物學教研室，哈爾濱 150086

柯薩奇病毒B組(coxsackie virus B，CVB)是引起病毒性心肌炎的主要病原體，在一部分患者CVB感染可發展為擴張型心肌病[1-3]。在研究CVB感染時，通常要對細胞或實驗動物的病毒感染情況進行定性或定量分析，或需要明確病毒在體內復制的部位及強度。對病毒感染的定性分析方法通常為觀察細胞病變(cytopathic effect, CPE)，而定量分析常用方法包括測定半數組織培養感染量(50% tissue culture infective dose, TCID50)、噬斑形成單位(plaque forming unit, PFU)，或通過反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)測定感染細胞內的病毒核酸含量[4-7]。以上幾種方法雖然很可靠，但除了對病毒感染細胞進行形態觀察以外，其他方法均很耗時，且操作復雜。近年來，廣泛應用的生物標記技術既可對病毒感染進行定性、定量分析，又可對病毒在體內感染過程進行示蹤[8-11]。熒光報告基因標記是目前常用的生物標記方法之一，其中編碼紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)的報告基因mCherry可用于研究多種病原體感染。mCherry的波長相對較長，可避免體內自發綠熒光的干擾[10,11]。對RNA病毒而言，由于RNA聚合酶缺乏糾錯功能，病毒在復制過程中易產生基因突變[12-14]。這一特點可能影響重組RNA病毒基因組的穩定性[15]。因此，如果要通過紅色熒光蛋白的表達對柯薩奇病毒B組3型(coxsackie virus B3，CVB3)的復制進行定性和定量分析，則有必要了解含mCherry報告基因的重組CVB3基因組的穩定性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、細胞及主要試劑 pMKS1由J. Lindsay Whitton教授(The Scripps Research Institute，California)惠贈。質粒peGFP-N1購自Clontech公司。重組質粒pCVB3-mCherry(圖1)攜帶嗜心肌的CVB3 H3毒株基因組全長cDNA及紅色熒光蛋白mCherry基因編碼序列由哈爾濱醫科大學微生物學教研室構建。該重組質粒的構建方法見文獻[14]，即以pMKS1為基礎，將序列兩端含內切酶SfiI識別序列的mCherry基因插入CVB3基因組5′端。mCherry的激發波長為580 nm，發射波長為610 nm。HeLa細胞由哈爾濱醫科大學微生物學教研室保存。質粒小量提取試劑盒、DNA小量膠回收試劑盒購自Axygen公司。DL2000 DNA Ladder、DL15000 DNA Ladder、pMD19-T Simple Vector、LATaq聚合酶和dNTP購自TaKaRa公司。真核轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。胎牛血清(fetal calf serum，FCS)購自以色列Biological Industries公司(Cat: 04-001-1A；Lot: 215356)。中性紅細胞染色液購自Sigma公司。細胞核染料Hoechst 33342購自Invitrogen公司，激發波長為350 nm，發射波長為480 nm。

圖1 CVB3-mCherry的結構Fig.1 The structure of CVB3-mCherry

1.1.2 主要儀器 主要儀器包括Mastercycler gradient PCR儀(Eppendorf)和Axiovert 200相差倒置熒光顯微鏡(Carl Zeiss)。

1.1.3 主要軟件及網站 Gene runner用于引物設計及多重序列比對；數據庫http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST用于基因組結構查詢及序列比對。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pCVB3-mCherry的擴增與純化 取保存于-80 ℃含重組質粒pCVB3-mCherry的菌液適量，接種于5 ml含氨芐西林的LB培養基中，于37 ℃搖床振搖12～16 h(180 r/min)，可見液體渾濁。取1.5 ml菌液加入離心管中，122 000g離心1 min，棄上清液。用質粒小量提取試劑盒提取質粒，檢測濃度及純度，-20 ℃保存備用。

1.2.2 pCVB3-mCherry在HeLa細胞中的瞬時表達 于24孔細胞培養板中培養HeLa細胞，24 h后選取生長狀態良好且生長至70%～90%單層細胞，用OPTI-MEMI培養基稀釋脂質體和質粒pCVB3-mCherry。轉染細胞時，脂質體與質粒的比為2 μl∶0.8 μg；轉染時設陽性對照(peGFP-N1轉染細胞)、陰性對照及未經任何處理的HeLa細胞對照；置培養板于37 ℃、 5% CO2培養箱中培養，24 h后觀察熒光表達及細胞病變情況。

1.2.3 病毒的收獲及傳代 用pCVB3-mCherry轉染HeLa細胞，當70%～90%細胞出現病變時，收獲細胞，反復凍融3次，于2 000g、4 ℃離心10 min，收集上清液，稱為第1代病毒，儲存于-80 ℃。用第1代病毒感染HeLa細胞，待70%～90%細胞出現病變時，收獲細胞，反復凍融3次，離心后收集上清液，稱為第2代病毒。以此類推，將病毒連續傳至第6代。

1.2.4 噬斑形成實驗及病毒毒力測定 將HeLa細胞以2.5×105個/孔接種于6孔細胞培養板中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養18～24 h。當細胞長至單層無縫隙時，用DMEM倍比稀釋 (10倍稀釋) 的病毒接種。每孔加入病毒稀釋液650 μl，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養1 h，棄病毒稀釋液；每孔加入2 ml固體培養基(含5% FCS的2×DMEM和1.6% 瓊脂糖，1∶1配制)，放入濕盒，置37 ℃、5% CO2培養箱，30 min后倒置培養72 h。鏡下觀察熒光表達及CPE，根據CPE情況進行染色。于細胞培養板中加入0.05%中性紅染色液，室溫作用1 h，棄染液。挑選培養板中噬斑未融合且噬斑個數適中的培養孔，鏡下計數噬斑個數，按以下公式計算病毒毒力：PFU/ml=每個稀釋濃度噬斑的平均值/(病毒的稀釋濃度×每孔病毒接種量)。

1.2.5 重組毒株的純化及穩定性評價 取第1代病毒用于噬斑形成實驗。挑取單個噬斑，接種于HeLa細胞進行擴增(100 ml規格培養瓶)，于37 ℃、5% CO2培養箱中靜置培養；當90%細胞出現CPE時，將細胞反復凍融3次，收獲病毒，此為純化后的CVB3-mCherry第1代病毒。以同樣方法純化第2～6代病毒。分別提取每代病毒總RNA，用RT-PCR擴增重組毒株中的mCherry報告基因及CVB3基因組部分序列，經0.7%瓊脂糖電泳觀察擴增產物片段大小。

HeLa cells transfected with pCVB3-mCherry in light microscopy (A) and fluorescence microscopy (B). Scale bar, 100 μm.

NC：HeLa cells without CVB3-mCherry infection； CVB3-mCherry: HeLa cells infected with the first passage of CVB3-mCherry.

A: RT-PCR strategy to analyze the stability of CVB3-mCherry. B: RT-PCR results. C : Cytopathic effect of CVB3-mCherry in HeLa cells in light and fluorescence microscopy. Panel 0 represents HeLa cells without virus infection. Panel 2-6 represent HeLa cells infected with the 2-6 passages of CVB3-mCherry.

PCR引物序列如下：上游引物(P1)5′-GGCGGCAGTGTGTCGTAACGGGC- AAC-3′(CVB3的5′ UTR區)，下游引物(P2)5′-GCGTGGTTCTGTGAACTTGCCCGGG-3′(CVB3的VP4區)。如果重組病毒基因組攜帶mCherry基因，擴增片段預期為1 160 bp；如果重組病毒基因組丟失報告基因mCherry，擴增片段應為455 bp。用pCVB3-mCherry、pMKS-1作為擴增模板的陽性對照，ddH2O為陰性對照。將擴增產物各片段用凝膠回收法純化，進行TA克隆，測序(北京英駿公司)后分析目的片段丟失規律。測序引物為PMD19T載體通用引物，引物序列為M13F-47(CGCCAGG-GTTTTCCCAGTCACGAC)和M13R-48(AGCG-GATAACAATTTCACACAGGA)。

2 結果

2.1 pCVB3-mCherry在HeLa細胞中的瞬時表達

用pCVB3-mCherry轉染HeLa細胞，培養60 h 后，光學顯微鏡下可見CPE，熒光顯微鏡下可見細胞內紅色熒光(圖2)，表明CVB3-mCherry可感染細胞并在細胞內復制，可用于CVB感染的體外研究。

2.2 CVB3-mCherry的毒力

用重組質粒pCVB3-mCherry轉染HeLa細胞，轉染60 h后檢測到紅色熒光，收獲第1代重組病毒，用噬斑形成實驗測得病毒毒力為9.3×106PFU/ml(圖3)。

2.3 CVB3-mCherry的穩定性

提取各代CVB3-mCherry基因組RNA，用于RT-PCR擴增。結果(圖4B)顯示，第2代和第3代重組病毒的擴增產物于1 160 bp處有較亮的條帶，455 bp處未見到條帶，但可見長度<455 bp的片段。隨著傳代次數遞增，擴增產物中的1 160 bp片段顯示的條帶逐漸模糊；同時，長度<455 bp的未知片段則隨病毒傳代次數的增加而變得清晰。此結果表明，報告基因mCherry的丟失開始于重組病毒的第2代；在mCherry基因片段丟失的同時，部分CVB3基因片段也隨之丟失。然而，第2～6代重組病毒所致的CPE沒有顯著區別(圖4C)。

將RT-PCR擴增產物中3個長度<455 bp的小片段回收純化，經TA克隆后測序，與重組質粒pCVB3-mCherry進行序列比對。其中RT-PCR獲得的3個小片段長度分別為435 bp、326 bp和256 bp。435 bp片段的產生是由于重組病毒丟失了包括插入的SfiI酶切位點及mCherry全序列，并因此導致病毒開放讀碼框架(open reading frame，ORF)移位，但無病毒基因序列丟失；326 bp片段的產生是由于丟失了mCherry及病毒的VP4區部分序列；而256 bp片段的產生則是mCherry和CVB3 ORF全部丟失的結果(表1、圖5)。

3 討論

CVB為單股正鏈RNA病毒，能引起人類多種疾病，可侵犯心臟、脊髓、胰腺、腎臟、腦等多個重要器官，是病毒性心肌炎的主要病原體[1-3]。目前，對CVB感染進行定性和定量的診斷方法仍以形態學觀察、測定PFU及RT-PCR為主。近年來熒光報告基因標記也廣泛用于病毒檢測。該方法更便捷，可用于病毒感染的定量分析及動態觀察，但目前對于攜帶熒光報告基因的重組CVB基因組的穩定性仍缺乏了解。

本研究結果表明，重組體CVB3-mCherry能在HeLa細胞內復制并產生明顯的CPE，可通過觀察紅色熒光蛋白表達情況來評價CVB的感染情況。此方法快速、簡便。與其他普通的紅色熒光蛋白相比，mCherry的優點在于有較長的發射波長、單體形式、在細胞內熒光轉換效率高，因而具有較高的信噪比，更易被檢測到；其次，檢測時無需底物，只需激發光，既方便又節約成本[10,11]。

Red thin lines represent the locations of the fragments obtained from the 2-6 passages of CVB3-mCherry.

表1 重組病毒CVB3-mCherry與其突變體基因序列分析結果比對Fig.1 Sequence alignment between the recombinant CVB3-mCherry and its mutated progenies

(續表)

(續表)

* represents the nucleotide that is retained in CVB3-mCherry; - represents the nucleotide that has been lost from CVB3-mCherry.

基因組不穩定是小RNA病毒的共同特征[12-14]。有研究報道，與報告基因增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)重組后，CVB基因組變得不穩定，在傳代過程中會丟失報告基因及部分CVB基因序列[15]。因此推測，隨著傳代次數的增加，CVB3-mCherry毒株的穩定性也可能有所變化。本研究表明，從第2代開始，重組病毒中就發生了報告基因丟失。丟失的序列包括插入的報告基因mCherry、CVB的5′ UTR區及部分VP4區。而第4～6代的重組病毒更不穩定，其中未發生基因片段丟失的病毒數量逐漸減少，表現為PCR產物中1 160 bp處的條帶越來越模糊，而發生基因丟失的病毒數量逐漸增加。序列分析表明，由于核酸序列丟失導致病毒ORF移位，因此會產生致死性突變株，使病毒失去原有的感染性。

本研究結果表明，與含報告基因eGFP的重組CVB3類似[15]，重組CVB3-mCherry基因組也具有不穩定的特點。雖然從第2～6代重組病毒所致的CPE看不出顯著變化，但包括CVB3自身基因片段在內的基因序列丟失從第2代就已存在。因此，應用時病毒傳代次數不宜超過2代；長期應用則需重新用重組質粒轉染敏感細胞以收獲病毒。此外，應通過噬斑形成實驗純化CVB3-mCherry毒株并測定其毒力。盡管如此，該重組體仍不失為研究CVB的方便且可靠的工具。

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