肺癌標志物識別的蛋白質組分析

丁燕 翻譯 曹志成 校對

1天津醫科大學總醫院，天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉移與腫瘤微環境重點實驗室；

肺癌是世界上癌癥死亡的主要原因。肺癌病變涉及許多基因突變和表觀遺傳學改變的復雜過程。識別反映啟動腫瘤進展通路的分子標志物或有助監測腫瘤狀態。

檢測并定量蛋白質的蛋白質組技術的改進，為試圖對疾病進行深入探索的研究人員創造了新的機遇和挑戰。高通量蛋白質組學技術聯合高等生物信息學被廣泛用于識別基于蛋白質通路和信號級聯的癌癥分子標志物[1]。肺癌特異性的蛋白質組學標志物開始涌現。

在最近發表的一篇文章中，Taguchi等 對數個小鼠肺腫瘤模型中的血漿蛋白質組與其它幾種腫瘤類型的血漿蛋白質組進行了對比，并識別出16種與肺癌相關的蛋白質。在EGF受體（EGFR）突變的肺腺癌模型中發現了一個涉及EGFR的蛋白質網絡，并在小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）模型中發現了一個與神經內分泌進展明顯相關的血漿標志物。隨后他們將該發現擴展至肺癌患者。其研究提示深入的定量蛋白質組學或可反映肺腫瘤生物學。本文評價了該發現的意義和影響，并討論了本領域一些相關的研究。

方法及結果

在遺傳工程小鼠模型中利用定量蛋白質組學方法，Taguchi等比較了四種肺癌模型（EGFRL858R腺癌、KrasG12D腺癌、p53lox/loxSCLC以及Rblox/loxSCLC）與其它腫瘤類型（乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、結腸癌以及前列腺癌）模型、兩種炎癥（急性和慢性）模型中的血漿蛋白質的表達譜。研究鑒別出一些可反映肺腫瘤生物學的血漿蛋白質譜，包括13種與肺腺癌特異性相關的蛋白質，以及3種蛋白質在肺癌中表達增加而在非肺腫瘤模型中卻未見增加。

編碼小鼠肺腺癌血漿中水平升高的四種蛋白質的同源基因（SFTPB、SFTPD、NPC2以及WFDC2）與TITF1/NKX2-1 mRNA水平呈正相關。其中，在111個非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）腫瘤中NPC2的表達與TITF1/NKX2-1 mRNA明顯相關。利用兩種肺腺癌細胞株進一步開展了TITF1/NKX2-1敲除實驗，發現這兩種細胞株的TITF1/NKX2-1均呈高表達。在NSCLC腫瘤中，34種潛在的TITF1/NKX2-1調節基因的蛋白質產物的表達與TITF1/NKX2-1 mRNA水平密切相關。

在EGFR突變和KRS突變肺腺癌小鼠模型以及SCLC小鼠模型中，生物反應路徑分析（Ingenuity Pathway Analysis）發現了涉及EGFR的蛋白質網絡，同時，對SCLC小鼠模型的血漿蛋白質組進行分析也發現了33種與神經疾病通路或神經系統進展及功能通路有關的蛋白質。

EGFR突變小鼠模型中的血漿EGFR網絡包括六種直接與EGFR結合的蛋白質（Met、Cd44、Cdh1、Ndn、Sh3bgrl以及Rin1）。有趣的是，僅在EGFR突變小鼠模型中觀察到Cd44（IPI00265503）的一種形態，而在KRS小鼠模型中未發現。對21種肺腺癌細胞株的蛋白質組學分析發現，在10種EGFR突變細胞株中，其中4種可見編碼CD44變異區的多肽，但在11種KRAS突變細胞株中均未觀察到。

對比厄洛替尼治療前后攜帶EGFRL858R轉基因荷瘤小鼠的血漿蛋白質譜，發現了小鼠血清中表達改變的91種蛋白質的表達水平恢復到基線水平。利用這一方法，亦發現了EGFR模型中可反映腫瘤進展和回歸的蛋白質。

兩組NSCLC人血液樣本（診斷前0-11個月以及新近診斷的吸煙者）、一組SCLC人血漿樣本及其匹配的非腫瘤對照中，應用ELISA方法對小鼠模型中發現的蛋白質進行檢測。在NSCLC患者中，EGFR水平降低，而SFTPB、WFDC2以及ANGPTL3水平升高。在擬診斷樣本組，該四種蛋白質聯合的曲線下面積（area under the curve, AUC）為0.808，新近診斷組的AUC為0.882。靶向于ROBO1外功能區的ELISA檢測亦顯示，與NSCLC患者及非腫瘤對照血漿中的水平相比，SCLC人血漿中ROBO1水平顯著升高。人肺癌樣本所得結果與來自小鼠模型的發現完全吻合。

討論

蛋白質濃度是動態變化的，且有時會隨著應激、疾病或治療發生明顯改變[3]。對有機體的蛋白質組進行檢測就好像在某一時間點對其活動進行“快照”。這可能會低估或錯失其余時間發生的過程的重要性。由于個體的異質性，Taguchi等選擇基因工程小鼠模型對肺癌蛋白質組進行研究是非常明智的。事實上，他們的研究不僅廣泛探索了不同組織類型肺癌模型的蛋白質組，而且通過可靠的方法進一步驗證了一些已發現的重要蛋白質，這為蛋白質組生物標志物的發現及驗證樹立了新的榜樣。

該研究采用了許多攜帶有不同肺癌類型以及不同腫瘤類型的小鼠模型。盡管如此，為強調腫瘤進展中的轉化變化，應納入良性和轉移性肺癌腫瘤模型[4]。他們也應用了兩種炎癥小鼠模型，目前小鼠模型仍是探討炎癥在肺癌進展中作用的熱點[5]。該研究所應用的急性、慢性炎癥動物模型有助于我們理解癌癥和炎癥模型之間的區別。為對肺癌進展有更明確的了解，納入肺相關炎性疾病（如：慢性阻塞性肺疾病）的小鼠模型從而對肺癌復雜的微環境進行更為徹底的研究或許更好[6]。

盡管每組小鼠血漿均受到三種最為豐富的蛋白質（白蛋白、IgG以及轉鐵蛋白）通過多重親和去除系統-3的免疫清除，一些已證實與肺癌相關的蛋白質在肺腺癌小鼠模型中并未被發現。作者解釋為質譜分析靈敏度不足或這些蛋白質在腫瘤進展早期并未明顯升高，需要更敏感的平臺以改善檢測性能。血清淀粉樣蛋白A作為另一廣泛存在的肺癌潛在生物標志物在研究所用的所有小鼠模型中均有發現但未被量化，該蛋白質值得量化，因為它或許是肺癌的潛在生物標志物[7]。

為驗證小鼠模型中所發現的蛋白質與人肺癌是否相關，該研究分析了自小鼠模型中發現的四種蛋白質的組合用以檢測26例擬診斷和28例新近診斷的人NSCLCs的潛在價值。他們的發現不僅驗證了小鼠與人肺癌血漿蛋白質變化的一致性，而且也提示這一組合的明顯變化可作為肺癌早期診斷的微創NSCLC特異性生物標志物。大型前瞻性多中心試驗或許有助于該組合標志物的臨床應用。

專家評論及5年展望

早期診斷有助于改善肺癌患者的生存，因此發現早期診斷生物標志物非常有意義[8]。該研究結果顯示對小鼠模型的蛋白質表達的定量對比分析將有助于研究擬診斷和新近診斷的人NSCLCs。事實上，定量對比蛋白質組學方法用途極廣，可以揭示許多問題。例如，Wei等利用該方法在肺腺癌細胞中發現了用于多藥耐藥和放療抵抗的蛋白質標志物[9]。他們共鑒定出四種表達上調的蛋白質（HSPB1、波形蛋白、cofilin-1和膜聯蛋白A4），這些蛋白質可作為預測人肺腺癌對化療和放療反應的潛在生物標志物。

目前發現的大多數腫瘤標志物對個別癌癥類型來說并非十分特異，這限制了它們在個別癌癥篩查中的應用。該項研究在已定量血漿蛋白質中成功應用聚類分析以揭示不同癌癥類型中多種模型的聚類。該方法或有助于克服生物標志物腫瘤類型特異性的挑戰。

新近大量基因研究已經發現包括不同信號通路在內的癌癥標志[10]。該研究分析了NSCLC及SCLC模型中的蛋白質網絡。突變EGFR肺癌模型血漿中EGFR網絡的發現或許揭示了驅動肺腫瘤進展的基因和通路，而SCLC模型中發現的蛋白酶體通路或可為SCLC提供潛在的神經內分泌靶標。事實上，研究已證實功能蛋白質組學是通路分析的可行方法。通過在肺癌中進行功能性磷酸化蛋白質組學分析，Sudhir等發現了Ras信號通路中的一些潛在靶標[11]，他們的研究發現了可由致癌性Ras調控的磷酸化過程、信號網絡和分子功能，應有助于開拓我們對肺癌中Ras信號的認識。Remily-Wood等利用液相色譜法串聯多級反應檢測質譜分析法以及GeneGO MetaCoreTM的通路地圖以明確蛋白質之間的生物關系并闡明多元化分析的理念[12]，他們最終研發了定量分析數據庫（Quantitative Assay Database）[101]，實踐了癌癥中信號通路和生物學過程的蛋白質組的定量分析。在不遠的將來，國際聯盟和更多開放存取的數據庫將成為現實。腫瘤生物學的探索正在涌現。

動物模型為轉化研究架起了橋梁[13]。該研究將小鼠模型中的發現與人體臨床樣本的驗證整合，這或可加速潛在的生物標志物用于NSCLC早期診斷的臨床實踐的成功。在未來5年內，我們預測多種蛋白質生物標志物將被用于腫瘤早期診斷。經大規模前瞻性多中心驗證后，蛋白質組學分析所支持的體外和體內數據將邁向臨床實踐[14]。

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關鍵發現

· 在肺腺癌小鼠模型中，深入的定量蛋白質組學發現了Titf1/Nkx2-1血漿蛋白質組。

· 血漿蛋白質標志物可反映肺癌的分子水平不同的亞型并反映肺腫瘤生物學。

· 在EGF受體突變模型中發現了一涉及EGF受體的蛋白質網絡，并且在小細胞肺癌模型中發現了一種不同的與神經內分泌進展相關的血漿標志物。

· 血漿蛋白質網絡揭示了一些可驅動腫瘤進展的基因。

· 小鼠模型中發現的蛋白質標志物與人肺癌樣本的ELISA結果一致。

· 對比四種肺癌小鼠模型與乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、結腸癌和前列腺癌模型及兩種炎癥模型的血漿蛋白質譜，在小鼠模型的血漿中共發現16種肺癌特異性蛋白質標志物。