西洋參組織培養研究進展

劉輝，高文遠，左北梅，董艷艷，王娟

（1.天津科技大學，天津 300457；2.天津大學藥物科學與技術學院，天津 300072；3.天津中醫藥大學，天津 300193）

西洋參PanaxquinquefoliumL.，又稱美國人參（American ginseng），原產于美國東部和加拿大，是五加科（Araliaceae）人參屬植物。具有補氣養陰，清熱生津的功能。西洋參的栽培周期較長，一般要4年時間，通過組織培養來生產西洋參的活性成分，可以節約土地，縮短培養時間，是西洋參資源解決的一條替代途徑[1-2]。本文綜述了西洋參組織培養的研究進展，為西洋參資源的研究提供參考。

1 西洋參愈傷組織的誘導

用于誘導西洋參愈傷組織的外植體，可以是不同參齡的根、根髓、莖段、葉片、葉柄、花藥、花蕾、胚及胚培養幼苗的子葉和胚軸等[3]，其中芽胞、種胚、葉柄和根都是較理想的外植體。愈傷組織的誘導率在68.7%～97.7%，最高可達100%[4]。除了外植體的取材部位，外植體的取材時期也會影響愈傷組織的誘導，5月下旬至6月上旬所取的外植體的愈傷組織誘導率可達95%以上，而6月下旬以后所取的外植體的愈傷組織的誘導率僅30%左右，而且愈傷組織生長緩慢[5]。西洋參芽胞的脫分化先從表面發生，以后逐漸向內生長，張美萍等[4]以西洋參根為外植體的實驗表明外植體的脫分化是發生在導管和篩管部位，由內部向外隆起，膨大，最后脹破外皮褥出愈傷組織。

用于西洋參愈傷組織誘導和繼代培養的基本培養基有MS，NB，B5等幾種，其中MS培養基誘導率最高，達到75.51%。研究發現，西洋參愈傷組織在MS培養基中生長較快，鮮重和干重都較大；在B5培養基中生長較慢，但有利于愈傷組織中人參皂苷的積累。培養基中成分的改變會對細胞生長和皂苷合成產生顯著的影響[6]。將 MS基本基質中KNO3、CaCl2和MgS04的濃度分別降低至原來濃度的1／8、1／6和1／4對西洋參培養物的生長有促進作用，降低KNO3和CaCl2的濃度不利于皂苷合成，但適當降低 MgS04的濃度利于皂苷合成。濃度為0.65 mmol·L-1的磷最有利于西洋參細胞的生長，而1.25 mmol·L-1的磷為皂苷和多糖合成的最適濃度[7]。范代娣等[8]將 MS培養基中 MgSO4·7H2O含量由370 mg·L-1降低到 92.5 mg·L-1，可使嫩莖愈傷組織誘導率提高到100%，愈傷組織生長速度提高1.33倍。

西洋參愈傷組織的誘導須添加生長素類物質，與細胞分裂素合用可起到促進作用。常用的生長素有 NAA（α-萘乙酸）、IBA（3-吲哚丁酸）、IAA（3-吲哚乙酸）和2，4-D（二氯苯氧乙酸）單獨使用均可誘導外植體產生愈傷組織，但IBA、NAA和IAA單獨使用時，誘導率都不高，而且脫分化時間較遲。以2，4-D（2～3 mg·L-1）和6-BA0.5 mg·L-1誘導率最高，達到75.51%～100%。在誘導愈傷組織時，2，4-D起主導作用，附加IBA對愈傷組織產生無明顯促進作用[6-9]。在 MS培養基中同時加入2，4-D（2.5 mg·L-1）、KT（0.8 mg·L-1）及 LH（700mg·L-1），對愈傷組織生長同樣具有促進作用[10]。

2 西洋參細胞懸浮培養

由于愈傷組織在固體培養基上增殖較慢，不適于進行大規模生產，而西洋參細胞懸浮培養比愈傷組織固體培養生長速度提高近80%。

西洋參細胞懸浮培養必須在有激素的培養液中進行。常使用的培養基主要是MS及其改良型，激素以NAA，2，4-D，6-BA最為常用，均能使細胞正常生長。其中以2，4-D效果最好，2，4-D與6-BA組合效果更佳。懸浮培養的繼代周期一般為18～20 d，此時的細胞生長旺盛，狀態好，細胞量大。pH變化對西洋參細胞生長影響不大，pH 6.0時，最有利于人參皂苷Re和西洋參多糖的合成。接種量為25 g·L-1時，西洋參細胞的干重增殖倍數顯著增加。培養溫度為（24±1）℃，此時的細胞生長狀態最好，顏色淺嫩黃色；生長量較大，生長速度快，延遲期短；在20℃和（28±1）℃時，細胞生長緩慢，尤其是28℃以上時細胞生長基本停止。光照顯著促進西洋參細胞次生代謝物的合成，但對多糖合成沒有太大影響[11-12]。

藥用植物細胞大規模培養已經在人參和紫草等植物上取得了成功[13-15]。目前實驗室常用的是氣升式發酵罐，相對于機械攪拌式發酵罐采用氣升式發酵罐更適合于植物細胞的大量培養[16]。采用40 L的氣升式發酵罐對西洋參細胞進行放大培養，考察氣升式反應器內培養過程中的流變學特性、傳質特性以及流場剪切應力變化規律，為以后的擴大培養及發酵罐的設計提供了有力的理論依據。通過兩步培養法，綜合考察蔗糖、MJ（茉莉酸甲酯）和LH（水解乳蛋白）可以使西洋參懸浮細胞中的皂苷產量比補料培養提高4.03倍，達到31.52 mg·L-1，為工業化培養中提高皂苷產量提供了一個新的思路[17]。

3 西洋參毛狀根與冠癭組織培養

毛狀根（Dairy Roots）是發根農桿菌（Agrobacterium Rhizogenes）感染雙子葉植物后，其Ri質粒上的T-DNA片斷整合進植物細胞核基因組中誘導產生的一種特殊表現型。西洋參的葉很難誘導毛狀根，葉柄則較為容易，尤其是帶部分葉的葉柄生命力強，也更易獲得毛狀根。西洋參毛狀根的建立已有成功的報道[18]。Archana Mathur等[19]將Ri-TL整合到rolA，rolB和rolC基因轉化獲得毛狀根經八周培養可增值10倍以上，皂苷產量達到0.2 g·g-1（干重）。賈冬梅等[20]利用發根農桿菌 A4菌株在西洋參根外植體上直接誘導產生發根，在1／2MS和MS固體培養基上得到西洋參發根，并在B5液體培養基上建立起發根離體培養系，利用紫外分光光度法測得西洋參發根的總皂苷含量達3.88%。

冠癭組織是指經根瘤農桿菌的Ti質粒轉化形成的轉基因器官——冠癭瘤（Crown Gall）。高鹽濃度的MS培養基最有利于西洋參冠癭組織的生長和人參皂苷Re的合成。蔗糖濃度為4%時，最利于組織的生長和總皂苷的累積，葡萄糖的加入會抑制冠癭組織生長和總皂苷的累積。NH4+用量一定的情況下，MS培養基中添加硝基氮，能夠明顯促進總皂苷的累積。冠癭組織最適生長溫度25℃，總皂苷累積的最適溫度為20℃。pH 5.2～5.6有利于總皂苷的累積，過高既不利于組織生長，也不利于皂苷的累積。接種量在2～6（gFW／flask）時，對西洋參冠癭組織生長較為有利；接種量為6（gFW／flask）時，人參皂苷Rb1含量明顯高于其他[21-23]。

對西洋參冠癭組織生物轉化能力的研究近年來成了一個新的熱點。西洋參冠癭組織具有促進植物體內的芳香族化合物糖基化、羥基化和甲基化反應的能力，如丹皮酚經西洋參冠癭組織可轉化為β-葡萄糖苷、1-（2，4-二甲氧基）-乙酮、β-葡萄糖苷[大黃素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷及其羥基衍生物，而大黃素也可轉化為β-葡萄糖苷[大黃素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷及其羥基衍生物[24]。Lin Yang等[25]也通過實驗表明西洋參冠癭組織的糖基化能力要遠強于煙草細胞懸浮體系。

毛狀根和冠癭組織培養是近些年才興起的培養系統，所以仍存在很多亟待解決的問題。由于西洋參與人參在植物形態、植物化學、細胞生理等方面很相似，因此，西洋參毛狀根的培養可借鑒人參毛狀根培養方面的研究報道[26-27]。另外離體毛狀根和冠癭組織往往不能合成所需產物，利用毛狀根和冠癭組織共培養、Ti和Ri質粒對植物進行雙轉化，可以有效解決此類問題[28-29]。

4 西洋參組織培養中提高有效成分含量的方法

有效成分含量的提高是藥用植物組織培養的難點，也是必須解決的問題。目前已經工業化培養成功的人參組織培養，皂苷含量比較穩定[30-31]。在西洋參細胞培養液中加入甘露醇，能明顯提高人參皂苷的含量，其含量是未加甘露醇含量的3倍，但滲透壓的提高對細胞的生長不利，導致生物量下降，影響人參皂苷產量[32]。而通過兩步培養法可以較好地處理培養過程中對細胞生長的不利因素，提高人參皂苷的產量[17]。在人參毛狀根的培養中，先把人參毛狀根在附加IBA（即3-吲哚丁酸）0.5mg·L-1的MS培養基中預培養72h后，再轉入不加激素的MS培養基中，6周后毛狀根中總皂苷含量達到5.19%，單體皂苷Re和Rg含量之和達到0.3271%[33]，此方法對西洋參毛狀根培養有一定的參考價值。

向細胞培養基中添加誘導子及前體化合物是提高有效成分含量的常用方法。常用的誘導子有MJ（茉莉酸甲酯）、LH（水解乳蛋白）、SA（水楊酸）和酵母提取物等。實驗表明多種誘導子的聯合應用可以更好地促進人參皂苷的積累。把紅花、人參、黑節草寡糖素添加到培養基中后，可使西洋參懸浮培養中Rg組的皂苷含量提高1.83倍[34]。方綺民等[35]在懸浮培養液中加入葡枝根霉，使西洋參中皂苷含量提2倍，且不減慢細胞的生長速率，皂苷產率高。在西洋參細胞懸浮培養中添加促進皂苷生物合成的3個前體：乙酸鈉、腳牛兒醇和角鯊烯，均可提高培養物中人參皂苷的含量[36]。此外，乙酸鈉也可以提高植物甾醇含量。3種前體中角鯊烯提高皂苷含量最為有效。

外源性植物激素的加入對培養物的生長及次生代謝產物的合成也會有一定的作用。常用的外源激素有萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）等。2，4-D 2mg·L-1、KT（0.05～0.1 mg·L-1）對西洋參愈傷組織中總皂苷產生有一定的促進作用[3]。2，4-D對Rb1的影響明顯，而2，4-D 0.5 mg·L-1較為適合Re的形成[37]。

5 結論與展望

綜上所述，西洋參的組織培養研究還很不充分，應當借鑒在人參細胞培養、毛狀根培養和不定根培養方面成功的經驗，設計更適于植物組織培養的生物反應器，通過分子手段明確西洋參次生代謝途徑，篩選高產細胞株，通過培養條件及培養方式的優化和誘導子的添加以提高目的產物的產量等，最終達到西洋參組織培養工業化的目的。