人sapovirus研究進展

劉淑華，楊宗照，謝 正

Sapovirus（SaV）即札幌病毒，又名札如病毒、沙波病毒，屬于杯狀病毒科（Caliciviridae），為單股正鏈RNA病毒，基因組全長7－8kb，帶有多聚A尾，沒有囊膜，病毒直徑27－35nm。SaV與人和動物的胃腸炎有關，不同年齡人群都可感染，以嬰幼兒最易感，能夠引起人（尤其是兒童和老人）的腹瀉，主要經糞—口傳播。SaV原型毒株于1977年發現于日本Sapporo（札幌）的一個孤兒院。近年來，在一些地方SaV逐漸成為僅次于諾如病毒（NoV），排列第二的腹瀉病主要病因［1］。

1 基 因

測出的第一個SaV基因組是 Hu／Manchester／93／UK，它屬于GII型。SaV包含有2個主要的開放閱讀框（ORF）。ORF1編碼一個多聚蛋白，經過蛋白酶處理后分解為幾個非結構蛋白和一個衣殼蛋白 （capsid，VP1）。ORF2 編 碼 一 個 堿 性 蛋 白（VP2），它是非結構蛋白。GI、GIV、GV型SaV還含有一個較小的ORF3，編碼一個堿性蛋白。

由于人的SaV不能進行細胞培養，因此不能使用中和試驗對SaV進行分型，比較普遍接受的分型方法是對衣殼蛋白全基因的序列分析。SaV被分為 GI．1－5，GII．1－6，GIV．1和 GV．1，即4個主型，13個亞型［2－3］。

2 SaV的流行病學

SaV可以感染人、豬、貂、蛤、牡蠣等，感染人的主要為GI、GII、GIV和GV型，感染豬的主要為GⅢ型以及少量其它類型，如GVI、VII型。

已經有報道發生SaV的國家有匈牙利、意大利、美國、日本、韓國、中國、丹麥、芬蘭、匈牙利、意大利、斯洛文尼亞、西班牙、愛爾蘭、巴西等。SaV在我國安徽、廣州、南京、南寧等地腹瀉病例中均存在該病毒，檢出的基因型有GI、II型，尚未有GIV、V型的報道。同一地區不同年份可能以不同的基因型為主［4］。日本6年的檢測結果顯示2003－2004年GI．1為主，此后2004－2005年 GI．6為主，2005－2007又以GI．1為主，2007－2008以 GIV為主，2008－2009以GI為主。有時也會檢測到多種的基因型，如Pang［5］對2004－2007年加拿大Alberta地區爆發的胃腸炎病例檢測，GI、GII、GIV、GV均有發生。

SaV可以從病人糞便、環境樣本（如廢水）、水產（蛤）、食品等中檢出［6］。如 Hansman年從河水中檢出GI、GV型SaV。蛤、廢水中檢測出的SaV與兒童腹瀉病例的SaV基因序列同源性非常高，提示可能存在食源性傳播。

發病季節方面，資料還比較少，以寒冷季節相對較多。日本流行季節為4－6月或10－12月［7］。Christina對丹麥的檢測沒發現有明顯的季節性。Dey［8］對孟加拉國2004－2005年的嬰幼兒急性胃腸炎病例監測發現發病以秋、冬季居多。

SaV常感染兒童，但也會導致成人發病。Wu［9］報道臺灣北部大學生發生SaV感染的報道。Mikula也報道了成人發病的例子。Pang［5］報道病例中發病年齡以老人（＞65歲）和兒童（＜6歲）為主。SaV在病人體內的排毒期通常為2w，但少數在發病后2～4w仍然排毒［10］。

不同的人群中該病的檢出率，除去SaV引起的爆發病例外，一般情況下少的只有0．5%，多的為10%～20%。Liu［11］對北京2007年7月至2008年6月腹瀉樣本557份的檢測，檢出率僅占0．5%。Chang［12］對2006－2007年福建、安徽等9省1 110份樣本檢測，10份（0．9%）為SaV 陽性，G I．1，G I．3，G II．3型均有。Nakanishi對腹瀉病例的檢測以輪狀病毒為主，其次是NoV、腺病毒，SaV只占了1．7%［13］，Chan－it［14］對 662 份 胃 腸 炎 兒 童 檢 測SaV陽性20例（3%），其中15例為G為GI．1，其次為GII．1、GI．3。Svraka［15］對芬蘭2007－2009年的檢測表明478次急性胃腸炎檢測，SaV引起的有19次（4%），主要為GI．2，發病年齡多為60歲以上的老人。

對于兒童的檢測結果中，輪狀病毒NoV、sapo－virus、腺病毒、星狀病毒是常見的幾種病毒性腹瀉的病原，如Lyman［16］對29次幼兒園急性腹瀉的檢測，其中13次（45%）為病毒性腹瀉，其中輪狀病毒、NoV、星狀病毒、SaV 分別為17%、10%、10%、7%的陽性率。Christina對丹麥0－3歲腹瀉兒童檢測SaV，97例（9%）為陽性，7－18個月齡相對高發，G1．1占陽性病例的一半。Rachakonda［17］對兒童腸胃炎病例226份的檢測結果表明23份（10．2%）為SaV陽性，22份為 GI，1份為 GII。Phan［7］檢測日本1154份2003－2005年腹瀉嬰兒和兒童，469份為腹瀉病毒陽性，其中SaV陽性49份（10．44%）。測序表明GI（GI．1、GI．4、GI．6和GI．8）型為主，GI．6是2004－2005年的主型。

在某些地區SaV是病毒性腹瀉的主要病因。Pang［5］對2004－2007年加拿大 Alberta地區爆發的胃腸炎病例檢測，SaV占17．6%（43／244）。

3 癥狀與致病性

一般而言嬰兒、兒童、成人感染后主要引起腹瀉，癥狀比NoV輕一點。但是也有引起嚴重病例的報道。在日本Sapporo孤兒院，暴發的36例傳染性胃腸炎病例，單獨由SaV、NoV、輪狀病毒引起的各有6、8、10例，由NoV和SaV混合引起的1例，腺病毒和星狀病毒各占3例和2例，Sav成為引起腹瀉的主要病原之一［18］。

Johansson［19］報道23名成年人感染SaV的癥狀情形。平均年齡52歲，惡心腹瀉、嘔吐、腹部痙攣、頭痛、肌肉痛、發燒等癥狀。發生腹瀉占72%，嘔吐占56%，癥狀持續時間為6d。

Usuku［20］對日本初中生一次學習旅行后發生胃腸炎病例檢查43份樣本，未檢出NoV和常見的食源性細菌（沙門氏菌、志賀氏菌、彎曲桿菌），而檢出了33份SaV（GIV）型，說明SaV可以引起胃腸炎疾病暴發。該文對癥狀統計數據見表1。

表1 SaV感染引起的疾病癥狀

Hansman［21］檢測了日本2006年2－3月幼兒園發生1名成年人和66名兒童（61．7%）和嘔吐、腹瀉，經檢查為SaV GI感染，此次沒有檢出輪狀病毒和NoV，說明SaV能夠引起較為嚴重的疾病流行。

2007年5月臺灣北部55名大學生有胃腸炎癥狀：腹瀉、嘔吐、肚子絞痛、發燒。癥狀持續10d（平均4．7d），抽檢8份樣本，未檢出細菌、輪狀病毒、NoV，電鏡觀察到杯狀病毒樣粒子。使用針對SaV衣殼蛋白的引物SV－F11、SV－R1檢測到7個樣本為陽性，熒光定量顯示每克糞便中的病毒cDNA拷貝數為0．286－172×108［22］。

據Wu報道SaV也引起嘔吐、腹瀉、肚子疼、發燒、脫水，持續12～60h［23］。

4 診 斷

實驗室主要的診斷方法有針對病毒病原、病毒RNA和抗體等檢測方法。電鏡和抗原ELISA可以檢測完整的病毒粒子和病毒抗原。RT－PCR檢測病毒RNA，檢測人SaV的熒光定量RT－PCR方法已經建立。重組的VLP被用來建立檢測抗體的ELISA方法。

4．1 電鏡（EM） 人的原型毒株Sapporo病毒首次發現是用電鏡。不過EM不很敏感，只能檢測到106／mL以上的病毒粒子。免疫電鏡可以增加敏感度（10倍以上），它的特異性取決于抗血清的質量。EM的缺點是需要熟練的操作人員、儀器昂貴、比較費時間，因此不適合大樣本的檢測。

4．2 RT－PCR 該方法最常用，不過 RT－PCR的影響因素較多，包括樣品的質量、RNA提取的方法、引物特異性、RT－PCR參數、檢測擴增產物的方法。巢式RT－PCR能提高敏感度10～1 000倍，但是也增加了交叉污染的風險。熒光定量RT－PCR增加了檢測的敏感度，而且檢測速度更快。

4．2．1 RNA的提取 提取時要考慮RNA的回收能力和去除RNA抑制劑的能力。常用的有酚－氯仿、Trizol、磁珠等方法提取。

4．2．2 引物的設計 一般有兩種策略：（1）使用針對檢測人的SaV的引物，不擴增其它動物的SaV，目前以這種方法的應用逐漸增多，大多數引物設計在相對保守的RdRp與衣殼蛋白連接區。但是即使是該區域的基因序列也有很大差異，因此常常需要設計較多的引物或設計兼并引物。（2）檢測杯狀病毒的通用引物是p290、p289，它們針對的保守區是RdRp區域的DYSKWDST、YGDD，這對引物通用性高但敏感度低，它能夠擴增人的SaV、NoV，甚至輪狀病毒。因此，這對引物的擴增結果需要測序以確定其特異性。

Okada［24］設計了針對人SaV GI、GII、GIV、GV型的RT－PCR，通過檢測臨床樣本，發現195份陽性，其中GI、GII、GIV和 GV分別有106、79、3和7份。GI和GII在樣本收集的8年內一致存在，另兩種出現的較晚。該方法是實驗室檢測SaV的較好的一種方法，它不但能夠檢測到各種基因型SaV，還能通過電泳區分，實際應用價值較大。

表2 檢測SaV的通用引物

圖1 針對SaV型與亞型的RT－PCR引物的位置

Yan［25］針對引起腹瀉有多種病毒，設計了同時檢測 NoV（GI、GII）、SaV、星狀病毒的 RT－PCR方法，其中 SaV 引物 序 列 為 SLV5317 5′－CTCGCCACCTACRAWGCBTGGTT－3′、SLV5749 5′－CGGRCYTCAAAVSTACCBCCCCA－3′。該方法的優點是可以同時檢出多種病原，比較節省勞動強度。不足是由于該方法設計的較早，主要是根據GI型SaV（Manchester／93、Sapporo／82、Houston／86）設計的，因此可能不能完全檢出所有類型的SaV。4．2．3 熒光定量 RT－PCR 與常規的 RT－PCR相比，熒光定量方法省去了電泳、雜交步驟，要快速、敏感，并且可以定量。

Oka［26］設計了檢測SaV的熒光定量方法，包含3條正向引物，2條MGBNFQ探針，1條反向引物，引物位置在多聚酶和衣殼蛋白的結合處，該方法的敏感度為每管25個拷貝。臨床試驗證實該方法可以檢出了SaV GI、II、IV、V型，具有較好的敏感度和特異性，不與星狀病毒、腺病毒反應。

表3 檢測SaV熒光定量RT－PCR的引物與探針

Chan［27］設計了的引物探針稍簡潔一些，有2條正向引物，1條MGBNFQ探針，1條反向引物來檢測所有類型的人SaV，其位置也是在SaV和衣殼蛋白連接處。通過臨床應用，證實該方法可以檢出了SaV GI、GII、GIV型，最低為10個拷貝／反應，不與輪狀病毒和NoV反應。

Logan［28］設計了實時 RT－PCR 方法同時檢測NoV、SaV和星狀病毒，但不是在同一管檢測，而是每種病分開檢測，檢測SaV的探針針對GI、II、IV型，而且使用使用FAM單一染料標記，因此對于測到的陽性樣本不能區分是哪種基因型。

van Maarseveen［29］針對當前導致腹瀉的病原較多這一問題，設計了同時檢測F群腺病毒、星狀病毒、輪狀病毒A群、NoV（GI、GII）和SaV的熒光定量方法。該方法敏感，提高了檢出率，但同樣該法設計的SaV引物是根據GI型序列（Mc114）設計的，可能不能完全檢出所有類型的SaV。

采用RT－PCR方法需要注意使用RT－PCR方法或者熒光定量方法檢出糞便中的排毒期在發生癥狀后14d絕大多數都轉為陰性，極個別仍可檢出。一些樣本需要稀釋以消除抑制性成分再擴增。在對水中SaV檢測時需要先過濾、離心等方法濃縮后再提取 RNA［30］。

4．3 免疫學方法 使用提純的病毒或桿狀病毒表達系統產生的病毒樣粒子產生的高免血清建立的抗原ELISA可以檢測病毒粒子或抗體，特異性比較高，但是由于SaV的變異度比較高，因此不能檢測所有的基因型SaV，限制了其應用。

5 消毒措施

專門針對SaV有效的消毒技術還未見報道，因此只能采用常規衛生和消毒措施。由于它屬于杯狀病毒，暫時可以參考針對其它杯狀病毒（如NoV）的研究報道。杯狀病毒抵抗力較強，在環境中可以保持數周，加熱和10×10－12的氯化物可以用作水質消毒。紫外線或γ射線可以滅活，乙醇、高溫等也有降低病毒滴度的作用。

6 總 結

盡管SaV已經發現30多年了，由于SaV暫時還不能使用合適的細胞培養，對于研究SaV非常不便。在國外一些地方，此病成為腹瀉疾病爆發的主要原因，但有時感染也不表現臨床癥狀，尤其對于青年人往往沒有癥狀。目前國內許多醫院還沒有對此病進行檢查，許多地方病人的感染情況、流行情況尚不十分清楚，還沒有疫苗可用，還缺乏針對SaV明確有效的消毒技術，這些不利因素給該病的檢測、預防與控制帶來較大難度。由于一些豬SaV與人的SaV抗原性和基因同源性較高引起了人們的關注。

［1］Harada S，Okada M，Yahiro S，et al．Surveillance of pathogens in outpatients with gastroenteritis and characterization of sapovirus strains between 2002and 2007in Kumamoto Prefecture，Japan［J］．J Med Virol，2009，81（6）：1117－1127．

［2］Hansman GS，Oka T，Katayama K，et al．Human sapoviruses：genetic diversity，recombination，and classification［J］．Rev Med Virol，2007，17（2）：133－141．

［3］Iwai M，Hasegawa S，Obara M，et al．Continuous presence of noroviruses and sapoviruses in raw sewage reflects infections among inhabitants of Toyama，Japan（2006to 2008）［J］．Appl Environ Microbiol，2009，75（5）：1264－1270．

［4］Chanit W，Thongprachum A，Khamrin P，et al．Intergenogroup recombinant sapovirus in Japan，2007－2008［J］．Emerg Infect Dis，2009，15（7）：1084－1087．

［5］Pang XL，Lee BE，Tyrrell GJ，et al．Epidemiology and genotype analysis of sapovirus associated with gastroenteritis outbreaks in Alberta，Canada：2004－2007［J］．J Infect Dis，2009，199（4）：547－551．

［6］Kitajima M，Oka T，Haramoto E，et al．Detection and genetic analysis of human sapoviruses in river water in Japan［J］．Appl Environ Microbiol，2010，76（8）：2461－2467．

［7］Phan TG，Trinh QD，Yagyu F，et al．Emergence of rare sapovirus genotype among infants and children with acute gastroenteritis in Japan［J］．Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2007，26（1）：21－27．

［8］Dey SK，Phan TG，Nguyen TA，et al．Prevalence of sapovirus infection among infants and children with acute gastroenteritis in Dhaka City，Bangladesh during 2004－2005［J］．J Med Virol，2007，79（5）：633－638．

［9］Wu FT，Oka T，Takeda N，et al．Acute gastroenteritis caused by GI／2sapovirus，Taiwan，2007［J］．Emerg Infect Dis，2008，14（7）：1169－1171．

［10］Iwakiri A，Ganmyo H，Yamamoto S，et al．Quantitative analysis of fecal sapovirus shedding：identification of nucleotide substitutions in the capsid protein during prolonged excretion［J］．Arch Virol，2009，154（4）：689－693．

［11］Liu LJ，Liu W，Liu YX，et al．Identification of norovirus as the top enteric viruses detected in adult cases with acute gastroenteritis［J］．Am J Trop Med Hyg，2010，82（4）：717－722．

［12］Chang ZR，Jin M，Liu N，et al．Analysis of epidemiologic feature and genetic sequence of Sapovirus in China［J］．Bing Du Xue Bao，2009，25（2）：113－116．

［13］Nakanishi K，Tsugawa T，Honma S，et al．Detection of enteric viruses in rectal swabs from children with acute gastroenteritis attending the pediatric outpatient clinics in Sapporo，Japan［J］．J Clin Virol，2009，46（1）：94－97．

［14］Chan－it W，Thongprachum A，Okitsu S，et al．Epidemiology and molecular characterization of sapovirus and astrovirus in Japan，2008－2009［J］．Jpn J Infect Dis，2010，63（4）：302－303．

［15］Svraka S，Vennema H，van der Veer B，et al．Epidemiology and genotype analysis of emerging sapovirus－associated infections across Europe［J］．J Clin Microbiol，2010，48（6）：2191－2198．

［16］Lyman WH，Walsh JF，Kotch JB，et al．Prospective study of etiologic agents of acute gastroenteritis outbreaks in child care centers［J］．J Pediatr，2009，154（2）：253－257．

［17］Rachakonda G，Choudekar A，Parveen S，et al．Genetic diversity of noroviruses and sapoviruses in children with acute spo－radic gastroenteritis in New Delhi，India［J］．J Clin Virol，2008，43（1）：42－48．

［18］Chiba S，Nakata S，Numata－Kinoshita K，et al．Sapporo virus：history and recent findings［J］．J Infect Dis，2000，181（S 2）：303－308．

［19］Johansson PJ，Bergentoft K，Larsson PA，et al．A nosocomial sapovirus－associated outbreak of gastroenteritis in adults［J］．Scand J Infect Dis，2005，37（3）：200－204．

［20］Usuku S，Kumazaki M，Kitamura K，et al．An outbreak of food－borne gastroenteritis due to sapovirus among junior high school students［J］．Jpn J Infect Dis，2008，61（6）：438－441．

［21］Hansman GS，Saito H，Shibata C，et al．Outbreak of gastroenteritis due to sapovirus［J］．J Clin Microbiol，2007，45（4）：1347－1349．

［22］Wu FT，Oka T，Takeda N，et al．Acute gastroenteritis caused by GI／2sapovirus，Taiwan，2007［J］．Emerg Infect Dis，2008，14（7）：1169－1171．

［23］Xavier MP，Oliveira SA，Ferreira MS，et al．Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador，an urban center in Northeast Brazil［J］．Braz J Med Biol Res，2009，42（5）：438－444．

［24］Okada M，Yamashita Y，Oseto M，et al．The detection of human sapoviruses with universal and genogroup－specific primers［J］．Arch Virol，2006，151（12）：2503－2509．

［25］Yan H，Yagyu F，Okitsu S，et al．Detection of norovirus（GI，GII），Sapovirus and astrovirus in fecal samples using reverse transcription single－round multiplex PCR［J］．J Virol Methods，2003，114（1）：37－44．

［26］Oka T，Katayama K，Hansman GS，et al．Detection of human sapovirus by real－time reverse transcription－polymerase chain reaction［J］．J Med Virol，2006，78（10）：1347－1353．

［27］Chan MC，Sung JJ，Lam RK，et al．Sapovirus detection by quantitative real－time RT－PCR in clinical stool specimens［J］．J Virol Methods，2006，134（1－2）：146－153．

［28］Logan C，O’Leary JJ，O’Sullivan N．Real－time reverse transcription PCR detection of norovirus，sapovirus and astrovirus as causative agents of acute viral gastroenteritis［J］．J Virol Methods，2007，146（1－2）：36－44．

［29］van Maarseveen NM，Wessels E，de Brouwer CS，et al．Diagnosis of viral gastroenteritis by simultaneous detection of Adenovirus group F，Astrovirus，Rotavirus group A，Norovirus genogroups I and II，and Sapovirus in two internally controlled multiplex real－time PCR assays［J］．J Clin Virol，2010，49（3）：205－210．

［30］Iwakiri A，Ganmyo H，Yamamoto S，et al．Quantitative analysis of fecal sapovirus shedding：identification of nucleotide substitutions in the capsid protein during prolonged excretion［J］．Arch Virol，2009，54（4）：689－693．