中國炭疽芽胞桿菌中11個串聯重復序列位點的特征和分布＊

魏建春，張恩民，張慧娟，張建華

炭疽芽胞桿菌是引起人和動物炭疽的病原菌，是一種相對保守的細菌，很多基因分型方法都不能對其分型，已經知道多位點串聯重復序列分析方法（MLVA）［1］和單核苷酸多態性分析（SNP）［2］是兩種比較有效的區別不同炭疽芽胞桿菌的方法。我們對本實驗室保存的炭疽芽胞桿菌菌株進行了MLVA的分析，發現有一些串聯重復序列（VNTR）位點在我國的菌株中很保守，在被試菌株中沒有區別或只有個別菌株出現變化，特對這些相對保守位點，進行進一步分析，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1．1 實驗菌株 本實驗室保存的109株炭疽芽胞桿菌，來自全國17個省份。

1．2 引物設計11個VNTR位點 MS15、MS21、MS22、MS23、MS25、MS28、MS44、vrrA、vrrB1、vrrB2、MS53擴 增 用 引 物 序 列 參 照 文 獻 報 道［1，3－4］，由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

1．3 材料 2×easy Taq Super Mix、DNA marker購自北京全式金生物技術有限公司，測序和毛細管電泳由北京擎科新業生物技術有限公司完成。

1．4 PCR擴增和檢測 反應體系：12．5μL 2×mix，1μL模板，上下游引物各0．2μmol／L，加水至25μL。VNTR位點 MS15、MS21、MS22、MS23、MS25、MS28、MS44使用以下擴增條件：95℃預變性5min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，30個循環，最后72℃延伸5min。上樣5μL，2%瓊脂糖凝膠5V／cm電泳2～3h。VNTR位點vrrA、vrrB1、vrrB2和MS53使用以下擴增條件：95℃預變性5min，95℃30s，60℃30s，72℃1min，34個循環，最后72℃延伸5min。擴增產物送公司進行毛細管電泳。

1．5 測序驗證 選擇部分擴增產物送測序。

1．6 序列比對BLAST和Megaline軟件進行序列比對。

2 結 果

2．1 保守位點的PCR擴增結果以及差異菌株在我國的分布 本實驗中11個位點比較保守，有4個位點 MS53，vrrB1，MS21，MS44，所試菌株擴增結果全部相同，擴增產物與已測序菌株Ames完全一致。另外7個位點中的5個，大多數的被試菌株表現出與Ames一致的特征，只有2個位點vrrB2和MS15，大多數被試菌株表現的特征與Ames不同，2個位點各檢測出1株與Ames相同的菌株。綜合11個VNTR位點，我國的菌株沒有檢測到與Ames完全相同的菌株。

在所試的109株菌中，僅10株菌與大多數菌株有差別，為分離自新疆的2株菌與分離自內蒙古的1株菌在2個位點上與大多數菌株不同，其他7株菌僅有1個位點與多數菌株不同。有差別的菌株多出現在新疆，新疆的4株菌6次檢測出與其他菌株不同，提示新疆的菌株類型比較復雜，見表1。

表1 11個VNTR位點的PCR擴增結果及差異菌株在我國的分布Tab．1 PCR results of 11VNTR loci and distribution of divergentstrains

2．2 擴增PCR產物所在基因特征 BLAST檢索發現這11個VNTR位點所在基因可分為3類，一類是MS28，MS44，MS25，MS23在炭疽芽胞桿菌中有基本明確的功能注釋，一類是 MS21，MS15，MS22在炭疽芽胞桿菌中沒有明確的注釋，但在與其近源的蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌中有與其同源性很高的基因，有相應的注釋可供參考；另一類是VrrA，VrrB1或 VrrB2，MS53在炭疽芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌中均為假想蛋白，沒有明確的功能注釋。詳細情況見表2。

表2 11個VNTR位點所在基因編碼產物Tab．2 The encoded proteins of these genes including 11VNTR loci

3 討 論

MLVA是目前對炭疽芽胞桿菌菌株鑒別和分型比較有效的方法之一。經常使用的有二十多個位點。本研究主要針對我國菌株中比較保守的位點進行分析。

新疆的菌株類型復雜前有報道［5］，本文發現的有差別的菌株多出現在新疆，雖然與本次試驗所用新疆菌株數量多有一定關系，但一樣顯示新疆的炭疽菌株確實復雜多樣。這可能與新疆地域廣大，病例較多，細菌有更多的機會發生變化有關。

BLAST比對發現本實驗所選的11個位點都在基因編碼區內，都以3的倍數重復，不會改變蛋白編碼序列，只是增加或減少相應的氨基酸個數。

4個位點所在基因的編碼產物在炭疽芽胞桿菌中有明確的注釋，包括青霉素結合蛋白（PBP）、細胞壁內肽酶NlpC／P60家族、芽胞殼組裝蛋白SafA、Internalins。PBP參與細菌細胞壁主要成分——肽聚糖合成的最后階段，在細菌生長、繁殖中發揮重要作用［6］。芽胞殼組裝蛋白SafA在芽胞殼的組裝過程中具有重要作用［7］。細胞壁內肽酶NlpC／P60家族，在細菌的生長發育繁殖過程中，通過水解肽聚糖的各種連接而使細胞壁重組［8］。Internalins是最初在單核細胞增多性李斯特菌中發現的表面蛋白，在細菌通過鈣粘素跨膜蛋白侵襲宿主細胞時使用，這些蛋白的確切作用以及侵襲力尚不完全清楚［9］。該蛋白與一個與鐵轉運有關的蛋白一致性較高487／572（85%），提示可能對于細菌的生長繁殖具有重要作用。

3個位點所在的基因序列與其近源的蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌相似，提示可能具有與蠟樣和蘇云金中相似的功能。其中值得一提的是MS15，MS15所在基因在炭疽芽胞桿菌中編碼BclD蛋白（Bacilluscollagen like protein），與芽胞外壁蛋白BclA相似。BclA蛋白是芽胞外壁發狀菌絲的主要結構成分，是主要的芽胞表面蛋白，影響芽胞的疏水性和粘附性。后來發現的BclB也鑒定是炭疽芽胞桿菌芽胞外壁的成分，之后又發現BclC、BclD、BclE、BclF和BclG等相似結構蛋白，可能具有與BclA和BclB相似的功能［10］。

還有4個位點所在基因沒有注釋明確的功能，似乎只是人們在炭疽芽胞桿菌中發現的具有高度可變性的群特異性的蛋白。已有文獻［11］提到VrrA是AVA疫苗在人體誘導的免疫反應的一個靶蛋白，提示它可能是炭疽芽胞桿菌的潛在毒力因子。這些沒有明確注釋的蛋白可能也具有一定的功能，因此在細菌生長繁殖過程中不易發生突變，即使突變也不改變蛋白的主要結構和功能。

本實驗中所選擇的VNTR位點都在基因編碼區內，所在基因的編碼產物可能在細菌的生長繁殖過程中具有比較重要的作用，因此不易發生突變。本文結果提示這些VNTR的變異度較小，可能不適用于我國炭疽芽胞桿菌的分子分型，但對于我們了解炭疽芽胞桿菌基因組特征以及炭疽芽胞桿菌的鑒定仍有一定的價值。

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